Generering av en lever Ortoämne humant uvealt melanom xenograft plattform i Immunobristfällig möss
Summary
Neobladder humant levermetastatisk ukalv melanom xenograft musmodeller skapades med hjälp av kirurgiska ortotopisk implantation tekniker med patient-derived tumör bit och nål injektion tekniker med odlade mänskliga ukalv melanom cellinjer.
Abstract
Under de senaste decennierna, subkutant implanterade patient-härledda xenograft tumörer eller odlade humana cellinjer har alltmer erkänts som mer representativa modeller för att studera mänskliga cancerformer hos immunobristfällig möss än traditionella etablerade mänskliga cell linjer in vitro. Nyligen, ortotopiskt implanterade patient-derived tumör xenograft (PDX) modeller i möss har utvecklats för att bättre replikera funktioner av patient tumörer. En lever neobladder xenograft musmodell förväntas vara en nyttig cancer forskningsplattform, som ger insikter i tumörbiologi och läkemedelsbehandling. Emellertid, lever ortotopisk tumör implantation är i allmänhet komplicerat. Här beskriver vi våra protokoll för ortotopisk implantation av patient-derived lever-metastaserande ukalv melanomtumörer. Vi odlade humana levermetastatiska uvealt melanom cellinjer i immunbrist möss. Protokollen kan resultera i genomgående hög teknisk framgång priser med antingen en kirurgisk ortotopisk implantation teknik med bitar av patient-derived ukalv melanom tumör eller en nål injektion teknik med odlade mänskliga cellinjer. Vi beskriver också protokoll för datortomografi att upptäcka inre levertumörer och för re-implantation tekniker med kryopreserved tumörer för att uppnå re-engraftelse. Tillsammans, dessa protokoll ger en bättre plattform för lever ortotopisk tumör musmodeller av levermetastatisk ukalv melanom i translationell forskning.
Introduction
Ukalvmelanom är den vanligaste intraokulära maligna tumören bland vuxna i västvärlden. Under de senaste 50 åren har incidensen av ukalvmelanom (5,1 fall per miljon) varit stabil i USA1,2. Ukalv melanom härrör från melanocyter i iris, ciliär kroppen, eller åderhinnan, och det är en extremt dödlig sjukdom när den utvecklar metastaser. Döds frekvensen för patienter med ukalv melanom metastaser var 80% vid 1 år och 92% vid 2 år efter initial diagnos av metastaser. Tiden mellan diagnos av metastaser och död är typiskt kort, mindre än 6 månader, utan avseende på terapi3,4. Cancern sprider sig genom blodet och tenderar att dominant metastasera till levern (89-93%)4,5. En effektiv musmodell behövs snarast för ytterligare utredning av levermetastatisk ukalv melanom. För translationell forskning, det finns en tydlig efterfrågan att generera en lever-lokaliserad metastaserad ukalv melanom musmodell.
Patient-derived tumör xenograft (PDX) musmodeller förväntas ge individualiserad medicin strategier. Dessa modeller kan vara prediktiva för kliniska resultat, vara användbara för preklinisk läkemedels utvärdering, och användas för biologiska studier av tumörer6. Representativa PDX modeller är ectopically tumör-implanterade xenograft möss, som har tumör vid subkutana platser. De flesta forskare kan göra kirurgi för subkutan implantation utan särskild praxis7,8. De kan också övervaka subkutan tumörer lätt. Även subkutana PDX-modeller blev populära i forskningsfasen, de har några hinder i att flytta till praktisk användning. Subkutan implantation tvingar patient-härledda tumörer att att på en annan mikromiljö från tumörens ursprung, så att det leder till engrafations misslyckande och långsam tumörtillväxt 9,10,11, 12,13,14. Ortotopisk inympelse kan vara en mer idealisk och rationell strategi för en PDX modell eftersom den använder samma organ som den ursprungliga tumören15,16.
Nyligen utvecklade vi protokoll för kirurgiska ortotopisk implantation tekniker för patient-derived lever-metastaserande ukalv melanomtumörer och nål injektion tekniker med en odlade mänskliga levern-metastaserande ukalv melanom cell linje i NOD. CG-prkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) möss17,18. Protokollen resulterar i genomgående hög teknisk framgång priser. Vi etablerade också CT scanning tekniker som är användbara för att upptäcka inre levertumörer, och vi utvecklat ny implantation av kryopreserved tumörer i PDX plattformen. Vi fann att ukalv melanom tumör xenograft modeller bibehålla egenskaperna hos den ursprungliga patienten lever tumör, inklusive deras histopatologiska och molekylära funktioner. Tillsammans, dessa tekniker ger en bättre plattform för lever ortotopisk tumörmodeller för ukalv melanom i translationell forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nuvarande ortotopiska xenograft-modellerna är arbetsintensiva, tidskrävande och dyra att skapa. Ortotopisk tumör xenograft musmodeller för levercancer etablerades mer än två decennier sedan19,20,21. Men denna teknik är komplicerad och kräver användning av särskild utrustning, såsom en mikro-nål hållare och 6-0 till 8-0 fina suturer under mikroskop. Tumör och normal levervävnad måste sys upp försiktigt så att…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot M. Ohara, K. Saito, och M. Terai, för att ha granskat manuskriptet. Författarna erkänner kritisk granskning för redaktionell och engelsk hjälp av detta manuskript av Dr. R. Sato på Fox Chase Cancer Center. Det arbete som beskrivs häri stöddes av Bonnie Kroll forskningsfonden, mark Weinzierl forskningsfonden, Eye melanom forskningsfond vid Thomas Jefferson University, Osaka community Foundation, och JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 på Osaka City University. Studier i Dr. A. Aplins laboratorium stöddes av NIH Grant R01 GM067893. Detta projekt finansierades också av en Dean ‘ s Transformative Science Award, en Thomas Jefferson University programmatiska Initiative Award.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
References
- Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4 (3), 145-151 (2018).
- Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
- Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98 (3), 383-389 (1991).
- Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123 (12), 1639-1643 (2005).
- Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119 (5), 670-676 (2001).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2352-2362 (2010).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3 (3), 413-422 (1993).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14 (20), 6456-6468 (2008).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3 (5-6), 469-482 (2009).
- Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15 (8), 451-452 (2015).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (2), 217-221 (2009).
- Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186 (1), 43-56 (2016).
- Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 145 (2017).
- Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (20), 9345-9349 (1991).
- Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6 (6), 2556-2561 (2000).
- Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Recherche en cancérologie. 72 (10), 2683-2691 (2012).
- Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25 (79), e50544 (2013).
- Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46 (4), 1186-1190 (2014).
- Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
- Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6 (9), e25692 (2011).
- Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Recherche en cancérologie. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Recherche en cancérologie. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6 (5), 14495 (2015).
