İmmünficient Farelerde Karaciğer Ortotopik İnsan Uveal Melanom Xenograft Platformu Üretimi
Summary
Ortotopik insan karaciğeri metastatik uveal melanom ksenogreft fare modelleri, hasta kaynaklı tümör öbek ve kültürlü insan uveal melanom hücre hatları ile iğne enjeksiyon teknikleri ile cerrahi ortotopik implantasyon teknikleri kullanılarak oluşturulmuştur.
Abstract
Son yıllarda, subkutan implante hasta kaynaklı ksenogreft tümörleri veya kültürlü insan hücre hatları giderek geleneksel kurulan insan hücresi daha immüneksik farelerde insan kanserleri çalışma için daha temsili modeller olarak kabul edilmiştir satırlar in vitro. Son zamanlarda farelerde ortotoik implante edilen hasta kaynaklı tümör ksenogrefti (PDX) modelleri hasta tümörlerinin özelliklerini daha iyi çoğaltmak için geliştirilmiştir. Bir karaciğer ortotopik ksenogreft fare modeli yararlı bir kanser araştırma platformu olması bekleniyor, tümör biyolojisi ve ilaç tedavisi içine anlayışlar sağlayan. Ancak, karaciğer ortotopik tümör implantasyonu genellikle komplikedir. Burada hasta kaynaklı karaciğer-metastatik üveal melanom tümörlerinin ortotopik implantasyonu için protokollerimizi açıklıyoruz. İnsan karaciğerini metastatik üveal melanom hücre çizgilerini immünoeksik farelere dönüştürdük. Protokoller, hasta kaynaklı uveal melanom tümörü parçaları içeren cerrahi ortotopik implantasyon tekniği veya kültürlü insan hücre hattı ile iğne enjeksiyon tekniği kullanılarak sürekli olarak yüksek teknik başarı oranlarına neden olabilir. Ayrıca iç karaciğer tümörlerini saptamak için BT taraması protokollerini ve kriyosrezerv tümörleri kullanarak yeniden implantasyon tekniklerini yeniden engraftment elde etmek için açıklıyoruz. Birlikte, bu protokoller çeviri araştırmakaraciğer metastatik uveal melanom karaciğer ortotopik tümör fare modelleri için daha iyi bir platform sağlar.
Introduction
Uveal melanom batı dünyasında yetişkinler arasında en sık görülen göz içi malign tümördür. Son 50 yıl içinde, uveal melanom insidansı (milyonda 5.1 olgu) Amerika BirleşikDevletleri’ndeistikrarlı kalmıştır 1,2. Uveal melanom iris melanositler doğar, silikal vücut, veya koroid, ve metastaz gelişir zaman son derece ölümcül bir hastalıktır. Uveal melanom metastazı olan hastaların ölüm oranı metastazların ilk tanısından 2 yıl sonra 1 yılda %80, 2 yıl sonra %92 idi. Metastaz tanısı ve ölüm arasındaki süre genellikle kısa, az 6 ay, tedavi ye bakılmaksızın3,4. Kanser kan yoluyla yayılır ve baskın karaciğermetastaz eğilimindedir (89-93%)4,5. Etkili bir fare modeli acilen karaciğer-metastatik uveal melanom daha fazla araştırma için gereklidir. Çeviri araştırma için, karaciğer lokalize metastatik üveal melanom fare modeli oluşturmak için net bir talep vardır.
Hasta kaynaklı tümör ksenogrefti (PDX) fare modellerinin bireyselleştirilmiş tıp stratejileri sağlaması beklenmektedir. Bu modeller klinik sonuçların tahmincisi olabilir, klinik öncesi ilaç değerlendirmesi için yararlı olabilir ve tümörlerin biyolojik çalışmalar için kullanılabilir6. Temsili PDX modelleri ektonik tümör implante ksenogreft fareler, deri altı sitelerde tümör var. Çoğu araştırmacı özel uygulama olmadan deri altı implantasyon için cerrahi yapabilirsiniz7,8. Ayrıca deri altı tümörleri kolayca izleyebilirler. Deri altı PDX modelleri araştırma aşamasında popüler hale gelmiş olsa da, pratik kullanıma geçişte bazı engelleri vardır. Subkutan implantasyon hasta kaynaklı tümörleri tümör kökenli farklı bir mikroortamda engraft için zorlar, böylece engreftasyon yetmezliği ve yavaş tümör büyümesine yol açar 9,10,11, 12,13,14. Ortotopik engraftment orijinal tümör15,16aynı organı kullandığı için bir PDX modeli için daha ideal ve rasyonel bir yaklaşım olabilir.
Son zamanlarda, nod kültürlü bir insan karaciğer-metastatik uveal melanom hücre hattı ile hasta kaynaklı karaciğer-metastatik uveal melanom tümörlerinin cerrahi ortotopik implantasyon teknikleri ve iğne enjeksiyon teknikleri için protokoller geliştirdik. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareler17,18. Protokoller sürekli olarak yüksek teknik başarı oranları ile sonuçlanır. Ayrıca iç karaciğer tümörlerini tespit etmek için yararlı olan BT tarama tekniklerini oluşturduk ve PDX platformunda kriyosayrılmış tümörlerin yeniden implantasyonu geliştirdik. Uveal melanom tümörü ksenogreft modellerinin histopatolojik ve moleküler özellikleri de dahil olmak üzere orijinal hasta karaciğer tümörü özelliklerini koruduğunu bulduk. Birlikte, bu teknikler çeviriaraştırmada uveal melanom için karaciğer ortotopik tümör modelleri için daha iyi bir platform sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut ortotopik ksenogreft modelleri emek yoğun, zaman alıcı ve oluşturmak için pahalı. Karaciğer kanseri için ortotopik tümör ksenograft fare modelleri fazla yirmi yıl önce kurulmuştur19,20,21. Ancak, bu teknik karmaşıktır ve mikro iğne tutucu ve 6-0-8-0 gibi özel ekipman kullanımını gerektirir bir mikroskop altında ince dikişler. Tümör ve normal karaciğer dokusu dikiş kırılgan karaciğer dokusuzar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Taslağı gözden geçiren Mösyö Ohara, K. Saito ve M. Terai’ye müteşekkiriz. Yazarlar Fox Chase Kanser Merkezi’nde Dr R. Sato tarafından bu el yazması editoryal ve İngilizce yardım için eleştirel inceleme kabul. Burada açıklanan çalışma Bonnie Kroll Araştırma Fonu, Mark Weinzierl Araştırma Fonu, Thomas Jefferson Üniversitesi Göz Melanomaraştırma Fonu, Osaka Toplum Vakfı ve JSPS KAKENHI Grant Numarası JP 18K15596 Osaka City tarafından desteklendi Üniversitesi. Dr. Aplin’in laboratuvarındaki çalışmalar NIH hibe R01 GM067893 tarafından desteklenmiştir. Bu proje aynı zamanda Bir Dekan Dönüştürücü Bilim Ödülü, Thomas Jefferson Üniversitesi Programlı Girişim Ödülü tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
References
- Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4 (3), 145-151 (2018).
- Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
- Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98 (3), 383-389 (1991).
- Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123 (12), 1639-1643 (2005).
- Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119 (5), 670-676 (2001).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2352-2362 (2010).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3 (3), 413-422 (1993).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14 (20), 6456-6468 (2008).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3 (5-6), 469-482 (2009).
- Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15 (8), 451-452 (2015).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (2), 217-221 (2009).
- Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186 (1), 43-56 (2016).
- Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 145 (2017).
- Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (20), 9345-9349 (1991).
- Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6 (6), 2556-2561 (2000).
- Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Recherche en cancérologie. 72 (10), 2683-2691 (2012).
- Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25 (79), e50544 (2013).
- Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46 (4), 1186-1190 (2014).
- Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
- Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6 (9), e25692 (2011).
- Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Recherche en cancérologie. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Recherche en cancérologie. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6 (5), 14495 (2015).
