Summary

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Published: February 19, 2020
doi:

Summary

Dit artikel introduceert monsterbereidingsmethoden voor een unieke real-time analytische methode op basis van de omgevingsmassaspectrometrie. Deze methode stelt ons in staat om real-time analyses uit te voeren van de biologische moleculen in vivo zonder speciale voorbehandelingen.

Abstract

Massaspectrometrie (MS) is een krachtig instrument in de analytische chemie omdat het zeer nauwkeurige informatie biedt over moleculen, zoals massa-ladingsverhoudingen(m/z),die nuttig zijn om moleculaire gewichten en structuren af te leiden. Hoewel het in wezen een destructieve analytische methode, recente vooruitgang in de ambient ionisatie techniek hebben ons in staat gesteld om gegevens te verwerven, terwijl het verlaten van weefsel in een relatief intacte toestand in termen van integriteit. Probe elektrospray ionisatie (PESI) is een zogenaamde directe methode omdat het geen complexe en tijdrovende voorbehandeling van monsters vereist. Een fijne naald dient als monsterpicker, evenals een ionisatiezender. Op basis van de zeer scherpe en fijne eigenschap van de sonde tip, vernietiging van de monsters is minimaal, waardoor we de real-time moleculaire informatie te verwerven van levende dingen in situ. Hierin introduceren we drie toepassingen van PESI-MS techniek die nuttig zullen zijn voor biomedisch onderzoek en ontwikkeling. Een daarvan omvat de toepassing op vast weefsel, dat is de fundamentele toepassing van deze techniek voor de medische diagnose. Aangezien deze techniek vereist slechts 10 mg van het monster, het kan zeer nuttig zijn in de routine klinische instellingen. De tweede toepassing is voor in vitro medische diagnostiek waarbij menselijk bloedserum wordt gemeten. Het vermogen om vloeistofmonsters te meten is ook waardevol in verschillende biologische experimenten waarbij een voldoende hoeveelheid monster voor conventionele analytische technieken niet kan worden verstrekt. De derde toepassing leunt naar de directe toepassing van sondenaalden bij levende dieren, waar we real-time dynamiek van metabolieten of drugs in specifieke organen kunnen verkrijgen. In elke toepassing kunnen we de moleculen afleiden die door MS zijn gedetecteerd of kunstmatige intelligentie gebruiken om een medische diagnose te krijgen.

Introduction

Massaspectrometrie (MS) is een technologische realisatie van reductionisme; het reduceert het analyseobject tot een eenheid die kan worden geïnterpreteerd op basis van moleculaire soorten of cascades. Daarom is het een representatieve methode van analytische chemie. Het bestaat uit vier processen: ionisatie, analyse, detectie en spectrale acquisitie. Omdat ionisatie van het molecuul het eerste proces in massaspectrometrie is, beperkt het over het algemeen de vorm van de te verwerken analyten. De meeste ionisatieprocedures vereisen de vernietiging van de structuur, morfologie en real-time biologische processen van organische monsters. Bijvoorbeeld, elektrospray ionisatie (ESI) MS vereist dat de monsters in een vloeibare toestand voor efficiënte ionisatie1. Monsters moeten daarom door een complex biochemisch preparaat gaan, dat de samenstelling van moleculen verandert. Als alternatief, terwijl matrix-assisted laser desorptie ionisatie (MALDI) MS moleculaire kaarten van dun gesectioneerd weefsel2,3kan reconstrueren, is de ionisatie-efficiëntie te laag om alle moleculen in de monsters te detecteren, en het is bijzonder slecht in het analyseren van vetzuren. Gezien deze beperkingen kan sondeelektrosprayionisatie (PESI)4 worden gebruikt om de real-time veranderingen in biologische systemen in situ waar te nemen zonder de structurele integriteit te vernietigen5, terwijl het biologische organisme dat wordt waargenomen technisch in levende staat is. Een zeer fijne naald wordt gebruikt in dit geval die gelijktijdig dient als een monster picker en een ionenzender. Dit betekent dat de complexe monstervoorbehandelingssequenties kunnen worden omzeild om massaspectra te verkrijgen die de moleculaire componenten van het levende systeem in situ weerspiegelen.

Er zijn verschillende andere ionisatiemethoden die wedijveren met PESI-MS. Een daarvan is snelle verdampingsionisatie massaspectrometrie (REIMS)6. Deze techniek werkt goed tijdens de operatie, omdat het is gemonteerd met een elektrisch mes en verzamelt de ionenpluim gegenereerd tijdens incisie. Terwijl REIMS is zeer nuttig voor de operatie, het is in wezen een destructieve methode die de elektrische ablatie van het weefsel vereist. Daarom is het niet nuttig voor de gedetailleerde analyse van cellen en weefsels in een preparatief monster of in laboratoriumanalyses. Bovendien, omdat het verzamelt een grote hoeveelheid pluim met weefselpuin, het vereist langdurig onderhoud van de apparaten na elk gebruik, waardoor het gebruik van deze machine te beperken tot speciale chirurgische ingrepen. Een soortgelijke methode, genaamd laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (LDI-MS)7, is een andere techniek die niet-invasief en nuttig voor het oppervlak analyse. Omdat deze techniek goed is in het scannen van het oppervlak van een monster, bereikt het uitgebreide tweedimensionale analyse zoals MALDI imaging massaspectrometrie8,9. Omdat LDI-MS echter alleen van toepassing is op de oppervlakteanalyse, is PESI-MS voordelig voor het analyseren van de monsters, bijvoorbeeld binnen het weefsel. Een andere techniek, de MasSpec Pen10, werd gemeld om een hoge specificiteit en gevoeligheid te bereiken bij de diagnose van schildklierkanker, maar de diameter van de sonde is in de orde van mm en het is specifiek voor de oppervlakte-analyse, wat betekent dat het niet kan detecteren kleine knobbeltjes van kanker of diep gelokaliseerde laesies. Aangezien deze methode gebruik maakt van een microcapillary flow canal ingebed in de sondepen, moet bovendien rekening worden gehouden met kruisbesmetting, vergelijkbaar met LDI-MS. Andere technieken bestaan die zijn toegepast op klinische instellingen, zoals de stroom sonde en ionisatie vorm swab11, maar ze zijn niet wijdverbreid.

PESI is extreme miniaturisatie van ESI, waarin de capillaire van de nano-elektrospray convergeert op een vaste naald met een tip kromming straal van enkele honderden nm. Ionisatie vindt plaats in het uiterst beperkte gebied van de naaldtip door een Taylor-kegel te vormen, waarop monsters blijven totdat de ionisatie van alle vloeistof op de punt is voltooid12. Als de analyt op de punt van de metalen naald blijft, wordt de overbelasting continu gegenereerd op de interface tussen de metalen naald en de analyten. Daarom vindt sequentiële ionisatie van moleculen plaats, afhankelijk van hun oppervlakteactiviteit. Deze eigenschap maakt de naald tip een soort chromatogram, het scheiden van de analyten, afhankelijk van hun oppervlakteactiviteit. Meer technisch, moleculen met de sterkere oppervlakteactiviteit komen aan het oppervlak van de Taylor kegel en worden geïoniseerd eerder dan die met een zwakkere oppervlakteactiviteit, die zich hechten aan het oppervlak van de naald tot het einde van het ionisatieproces. Zo wordt volledige ionisatie van alle moleculen die door de naald worden opgepikt bereikt13. Bovendien, omdat deze techniek niet de toevoeging van overbodig oplosmiddel aan het monster impliceert, volstaan enkele honderden femtoliters om massaspectra sterk genoeg te krijgen voor verdere analyse14. Deze eigenschappen zijn gunstig voor de analyse van intacte biologische monsters. Een groot nadeel van PESI-MS ligt echter in de discontinuïteit in ionisatie vanwege de wederkerige beweging van de naald langs de verticale as, vergelijkbaar met een zaagmachine. Ionisatie vindt alleen plaats wanneer de punt van de sonde het hoogste punt bereikt wanneer de hoogte van de ionenopening op de horizontale as is uitgelijnd. Ionisatie stopt terwijl de naald monsters oppikt, en dus is de stabiliteit van ionisatie niet gelijk aan die in conventionele ESI. Daarom is PESI-MS geen ideale methode voor proteomics.

Tot op heden is PESI-MS voornamelijk toegepast op de analyse van biologische systemen, die een breed scala aan gebieden bestrijken, van fundamenteel onderzoek tot klinische instellingen. Bijvoorbeeld, de directe analyse van menselijk weefsel voorbereid tijdens de operatie was in staat om de accumulatie van triacylglycerol onthullen in zowel niercel carcinoom15 en faryngeal plaveiselcarcinoom16. Deze methode kan ook vloeibare monsters, zoals bloed, meten om zich te concentreren op het lipideprofiel. Sommige moleculen zijn bijvoorbeeld afgebakend tijdens veranderingen in het dieet bij konijnen; er werd gemeld dat sommige van deze moleculen in zeer vroeg stadium van de experimenten afdaalden, wat wijst op de hoge gevoeligheid en het nut van dit systeem voor klinische diagnose17. Bovendien, directe toepassing op een levend dier toegestaan de detectie van biochemische veranderingen van de lever na slechts een nacht van vasten5. Zaitsu et al.18 revisited dit experiment5 en analyseerde de metabole profielen van de lever op bijna dezelfde manier, met resultaten die de stabiliteit en reproduceerbaarheid van onze oorspronkelijke methode versterkt. Bovendien waren we in staat om het kankerweefsel te discrimineren van omliggende niet-kankerlever bij muizen met behulp van deze techniek19. Daarom is dit een veelzijdige massaspectrometrietechniek die nuttig is in verschillende omgevingen, zowel in vivo als in vitro. Vanuit een ander oogpunt kan de PESI-module worden gemaakt om verschillende massaspectrometers te passen door de montagebevestiging aan te passen. In dit korte artikel introduceren we de basisprincipes en voorbeelden van toepassingen (figuur 1),inclusief toepassingen met levende dieren5.

Volgens de verordeningen en wetten in elk land moeten delen van dit protocol worden herzien om aan de criteria van elke instelling te voldoen. Toepassing op het levende organisme is de meest interessante en uitdagende omdat het biochemische of metabole veranderingen in weefsels of organen in levende dieren in situ kan bieden. Hoewel deze aanvraag werd goedgekeurd door het institutioneel comité voor dierverzorging aan de Universiteit van Yamanashi, zal in 20135,een nieuwe goedkeuringsronde nodig zijn vanwege recente wijzigingen in de regelgeving voor de dierproeven. Verschillende wijzigingen in de experimentele regeling zijn daarom aan te raden. Met betrekking tot de massaspectra verkregen in experimenten, rekening houdend met de schommelingen van massaspectra tussen elke meting, is er geen spectrale informatie-uitwisseling systeem dat gemeenschappelijk is voor de nucleotide sequencing gemeenschap. Er moet voor worden gezorgd wanneer de bediener de naald hanteert om ongevallen met de naaldprik te voorkomen, vooral bij het verwijderen van de naaldhouder. Een speciaal apparaat voor het losmaken van de naald is hiervoor zeer nuttig. Aangezien het compartiment van de PESI-module een luchtdichte, gesloten kamer is, treedt lekkage van de ionenpluim niet op als de massaspectrometer volgens de instructies wordt bediend.

Protocol

Het institutioneel comité voor dierverzorging aan de Universiteit van Yamanashi keurde alle protocollen en het gebruik van proefdieren goed die hierin worden vermeld. Menselijk monster gebruik werd goedgekeurd door de institutionele ethiek raad van de Universiteit van Yamanashi. 1. Vaste weefselbereiding OPMERKING: Monsters moeten na verwijdering uit het dier of het menselijk lichaam op ijs worden gehouden om de versheid van het weefsel te behouden. Als metingen niet…

Representative Results

Zoals afgebeeld in figuur 3, zijn de gegevens verkregen door pesi-ms-techniek de massaspectra, waarvan de m/z in dit systeem varieert van 10 tot 1.200. Terwijl men moleculen tot m/z 2.000 kan ontdekken, waren er weinig pieken verkregen met behulp van deze techniek over het massabereik van m/z 1.200. Daarom analyseerden we pieken van m/z 10 tot 1.200. Er waren opvallende groepen pieken rond m/z 800 en 900; de eerste…

Discussion

Hoewel PESI een afgeleide is van ESI voor massaspectrometrie4, is het het meest voordelig voor het monitoren van real-time metabolomica, evenals voor het analyseren van biochemische reacties zonder complexe of tijdrovende voorbehandelingenuit tevoeren 5,14,15,17. Het is een eenvoudige en onmiddellijke massaspectrometrie techniek die kan worden toegepast op de geïntegree…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Ayumi Iizuka voor de exploitatie van de PESI-MS en Kazuko Sawa-nobori voor haar secretariële hulp. Wij danken Bronwen Gardner, Ph.D., van Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp van dit manuscript.

Materials

5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) Sigma-Aldrich F8791-25MG 25mg
disposable biposy punch (Trepan) kai Europa GmbH BP-30F bore size 3mm
ethanol nacalai tesque 14710-25 extra pure reagent
LabSolutions Shimadzu ver. 5.96, Data analyzer
micropestle United Scientific Supplies S13091
microtube Treff 982855 0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) Shimadzu DPiMS-2020 Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition Shimadzu ND Attached to DPiMS-2020

References

  1. Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
  2. Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  3. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
  4. Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
  5. Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
  6. Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
  7. Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
  8. Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
  9. Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
  10. Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
  11. Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
  12. Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
  13. Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
  14. Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
  15. Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
  16. Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
  17. Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
  18. Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
  19. Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
  20. Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
  21. Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
  22. Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
  23. Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
  24. Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
  25. Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology – Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
  26. Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).

Play Video

Citer Cet Article
Takeda, S., Yoshimura, K., Tanihata, H. Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (156), e59942, doi:10.3791/59942 (2020).

View Video