Præsenteret her er en enkel at bruge, kerne/shell, tredimensionel bioprinting set-up for One-Step fabrikation af hule stilladser, egnet til vævs konstruktion af vaskulære og andre rørformede strukturer.
Tredimensionel (3D) trykning af kerne/Shell filamenter giver mulighed for direkte fabrikation af kanal strukturer med en stabil shell, der er tværbundet på grænsefladen med en flydende kerne. Sidstnævnte er fjernet efter trykning, efterlader et hult rør. Integrering af en additiv fremstillingsteknik (som den, der er beskrevet her med skræddersyede [bio] blæk, som strukturelt og biokemisk efterligner den indfødte ekstracellulære matrix [ECM]) er et vigtigt skridt i retning af avanceret vævsteknik. Men præcis fabrikation af veldefinerede strukturer kræver skræddersyede fabrikations strategier optimeret til det materiale, der er i brug. Derfor er det fornuftigt at begynde med en opsætning, der er tilpasselig, enkel at bruge, og kompatibel med et bredt spektrum af materialer og applikationer. Dette arbejde præsenterer en nem at fremstille kerne/Shell dyse med luer-kompatibilitet til at udforske kerne/Shell trykning af træpæle strukturer, testet med en veldefineret, alginat-baseret stillads materiale formulering.
Det ultimative mål for vævsteknik (te) er at fremstille funktionelle væv eller organer in vitro, som kan bruges til at regenerere eller erstatte skadede eller syge dele af den menneskelige krop1,2,3. Aktuel forskning i vævsteknik (TE) er fokuseret på de enkelte aspekter af området (stilladser materialer, fabrikations procedurer, celle kilder osv.) 4,5, samtudvikle enkle in vitro-modeller af væv og organer, der efterligner grundlæggende aspekter af deres in vivo modparter. Sådanne modeller er allerede nyttige for mange applikationer, såsom Drug screening og toksicitetsundersøgelser, især i tilfælde, hvor konventionelle 2D cellekulturer undlader at efterligne den dynamiske respons af de indfødte væv6,7, 8,9. Tredimensionale in vitro-modeller er normalt konstrueret ved at kombinere celler10, fysisk-kemiske signaler11, og biologisk aktive molekyler12,13 på stilladser, som er fremstillet af decellularized væv eller konstrueret de Novo fra biologiske eller biokompatible materialer14,15,16,17,18.
Det er afgørende, at stilladser rekapitulere den komplekse 3D mikroarkitektur og hierarkisk struktur af de indfødte væv til at muliggøre funktionaliteten af de manipulerede væv, repræsentant for in vivo væv19. På trods af de betydelige teknologiske fremskridt i TE, er udvikling af fysiologisk relevante kunstige væv konstruktioner fortsat en udfordring. Tyk væv (> 200 μm i tykkelse) er særligt problematisk, på grund af begrænsninger såsom ilt og næringsstof diffusion20. Der er gjort fremskridt i retning af større vævs konstruktioner; men den påkrævede høje nærhed af celler til blodkar for at transportere ilt og næringsstoffer og fremme fjernelse af affald skal gentages. Vaskularisering af væv (eller alternativt fabrikation af indbyrdes forbundne 3D-vaskulære netværk inden for vævs konstruktioner) spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af cellernes levedygtighed og fremme af funktioner i in vitro-udviklede væv, hvilket er vanskeligere for modeller i længerevarende eksperimenter21,22. Desuden er den nødvendige opløsning, strukturel integritet og samtidig biokompatibilitet endnu ikke opnået23.
Flere TE tilgange er blevet foreslået i et forsøg på at konstruere blodkar-lignende strukturer og lette vaskularisering in vitro. Nogle eksempler omfatter såning endotelceller (også co-kultiveret med andre celler typer såsom fibroblaster), der selv samler til at generere microvaskulære netværk24, brug af vaskulære stamceller og pericytes, der fremmer endotel celle vækst21,25, levering af angiogeniske vækstfaktorer, der inducerer vaskularisering20,26, ved hjælp af celle plade teknologi, der giver mulighed for kontrol over vaskulære lagdeling20, og fabrikation af meget porøse stilladset strukturer, der fremmer angiogenese27. De nævnte tilgange fokuserer på angiogenese induktion, som generelt kræver betydelige mængder af yderligere vækstfaktorer (f. eks. VEGF) og tid til dannelse. Men de største ulemper er deres begrænsede reproducerbarhed og begrænset rumlig kontrol over vaskulære mønster, hvilket sædvanligvis resulterer i en tilfældig vaskulatur fordeling inden for vævs konstruktionen, der ikke nødvendigvis letter perfusion.
Additiv fremstilling (AM, såsom 3D bioprinting) er i stigende grad involveret i fabrikation af 3D-konstruktioner ved hjælp af biologiske eller biokompatible materialer til at skabe stilladser egnet til TE. Flere AM tilgange anvendes og udvikles parallelt (f. eks, ink jet-og microekstrudering-baserede metoder, forskellige typer af litografiske teknikker) til at producere stilladser, der efterligner indfødte væv i deres arkitektur, biokemi, og funktionalitet . De enkelte teknikker udviser visse fordele og ulemper28, hvilket er grunden til forskellige modifikationer, der udforskes (f. eks. mikromønster, induceret angiogenese osv.) for at øge omfanget af, hvor store, komplekse og stabile vaskulære netværk kan fabrikeres22,29,30.
Blandt disse, ekstrudering bioprinting er den mest almindeligt anvendte metode, især på grund af den brede vifte af kompatible materialer (en generelt celle-venlige proces28,31,32) samt ekstraordinær alsidighed i anvendelsesbetingelser (f. eks. indlejret og offer trykning23,33, fabrikation af hule konstruktioner34,35osv.). De vigtigste udfordringer, der optager de nuværende undersøgelser, omfatter overførsel fra 2D til 3D-strukturer, dannelse af et tæt netværk af hule rør med høj rumlig opløsning og generel mekanisk integritet og form troskab under væskestrømmen i cellekulturen betingelser30.
Den mest ligefremme tilgang til perfbrugbart væv er fremstilling af et sammenkoblet netværk af kanaler inden for konstruktionen. Skabelsen af sådanne perfbrugbare kanaler inden for en vævs stilladset forventes at løse mange af de førnævnte problemer, da det straks giver mulighed for næringsstof og ilt diffusion samtidig fjerne affald produkter. Derfor undgås den potentielle dannelse af nekrotiske regioner i konstruktionen36. Sådanne kanaler kan desuden seedet med endotelceller (ECs) og fungere som kunstige blodkar i 3D-vævs modeller37. I den mest elementære forstand, kan et fartøj bestå af en hul kanal, blødt lag af ECs, og stiv shell. For nylig, 3D ekstrudering af to forskellige materialer i en kerne/Shell mode udnytter Co-Axial nåle til ekstrudering har vundet stor interesse38,39,40,41, da det giver mulighed for fabrikation af hule rør.
På samme måde som konventionel microextrusion 3D-udskrivning udføres kerne-/Shell-udskrivning med en koaksial dyse (f. eks. to nåle med forskellige diametre, der er justeret på samme akse på en facon, således at den bredere nål omgår den smallere). Således kan to materialer ekstruderes samtidigt, med en som den centrale glødetråd eller “indre” kerne og et sekund som den “ydre” Shell41. Til dato, Co-Axial bioprinting er blevet udnyttet til at fabrikere strukturer med solid42, Core/Shell43, og hule tråde40,44; men de anvendte materialer er ikke blevet optimeret til både optimal cellelevedygtighed og mekanisk robusthed af de trykte konstruktioner. Som nævnt giver teknikken mulighed for at kombinere biomaterialer med forskellige mekaniske egenskaber, hvor stivere en understøtter den blødere. Endnu vigtigere er det, at hvis stilladset materiale (f. eks. alginat, carboxymethylcellulose) ekstruderes som skallen, mens kernen består af tværbindende middel (f. eks, calciumchlorid) dispenseres fra den indre kapillar derefter skyllet ud efter trykning, er det muligt at fabrikere et kontinuerligt hult rør i et enkelt trin45.
Med dette i tankerne, en enkel og gentagelig en-trins metode blev udviklet til at opbygge veldefinerede og perfektuelt stilladser til ingeniørarbejde af vaskulære strukturer og andre rørformede væv. For at udvikle en omkostningseffektiv teknologi bør fabrikation ideelt set være en enkelt trins proces. Derfor blev en Core/Shell set-up tilpasset og integreret i 3D bioprinter. Det grundlæggende design består af en central dyse lavet af metal for at undgå deformation under injektion, omkring hvilken en anden dyse af en større diameter er placeret. En sådan koaksial dyse opsætning giver mulighed for Co-ekstrudering af de to strømme og umiddelbar tværbinding af den extruderede hydrogel kanal. Dette muliggør direkte fabrikation af flerlags hule filamenter, mens efterfølgende tværgående sammenkobling med højere koncentrationer af calciumchlorid (CaCl2) sikrer mere permanent stabilisering udefra.
Som sådan giver denne metode mulighed for samtidig trykning af stilladser og mikrokanaler, hvor de hule hydrogel filamenter tjener som et stillads til at understøtte den mekaniske integritet af 3D-konstruktioner og samtidig fungere som indbyggede mikrokanaler til at levere næringsstoffer til cellevækst. Denne protokol giver en detaljeret procedure af Core/Shell 3D bioprinting strategi baseret på brug af en skræddersyet koaksial dyse, hvor hydrogel 3D strukturer med indbyggede kanaler er fabrikeret ved at kontrollere tværgående sammenkædning til at producere hule filamenter, som forbliver perfbrugbar under cellekulturen.
Den 3D-udskrivnings opsætning, der anvendes i dette arbejde, er konfigureret som tidligere beskrevet af Banović og Vihar46 og kan opdeles i tre hovedkomponenter: a) en tre-akse CNC mekanisk opsætning med 50 μm positionering nøjagtighed i X, Y, og Z retninger; B) to ekstrudere, tilpasset til engangsbrug, 5 mL luer-Lock sprøjter, med 1,2 μL voxel opløsning; og C) styring af elektronik og software.
For at lette Core/Shell udskrivning, en passende dyse blev udviklet, der kan monteres på en af ekstrudere (primære ekstruder, trykning kernen) og er kompatibel med G27 stump-ende nåle. Det har også luer-Lock kompatibilitet til at forbinde med den anden ekstruder (udskrivning af shell). De første prototyper blev fremstillet ved at indsætte en stump ende G27 nål (indvendig diameter = 210 μm, udvendig diameter = 410 μm) i enten en G21 nål (indvendig diameter = 510 μm, udvendig diameter = 820 μm) eller G20 konisk spids (indvendig diameter = 600 μm), og derefter indsætte en sekundær n på sidelinjen for at forsyne Shell materialet. Men på grund af en let bøjning af nåle akslen, er det ikke muligt at producere en dyse spids med koncentrisk justering af de indre og ydre nåle.
For at løse dette problem, en ny dyse design blev udtænkt, der opfyldte følgende kriterier: 1) det kan fremstilles ved hjælp af en 3-akse CNC mølle, 2) det kan være fremstillet af forskellige materialer (højtydende plast, såsom PEEK eller metaller), 3) det har luer-Lock kompatibilitet for påføring af shell materiale, og 4) er kompatibel for en G27 stump-ende nål og holder den på plads på to positioner for at justere spidsen med den centrale akse. En skematisk af dyse prototypen er vist i figur 1.
Dyse design
Ved hjælp af den udviklede kerne/Shell dyse, integreret i en to-ekstruderet Vitaprint system, hule, tubulære stilladser blev fabrikeret i en enkelt-trins proces. For at opnå en jævn tykkelse af rørvæggen gennem de fleste af de forberedte stilladser skal nålen placeres centralt på aksen af den ydre ekstruderingringring. Standard måler nåle udviser ofte en lille, men signifikant excentricitetoff af aksen. Således var dysen kroppen designet til at holde nålen to steder, en gang i toppen (fastgørelse af navet) og en gang før den endelige kerne/Shell kammer (fastsættelse af kanyle selv), korrigere sin aksiale justering. Præcisionen af den aksiale justering øges med afstanden mellem fikserings punktet. Der er dog en afvejning mellem nåle længde og tilgængelige dyse kammervolumen. For at forbedre funktionaliteten af set-up yderligere kan visse ændringer af dysen implementeres: A) en dyse montering med forbedret stabilitet, B) yderligere dyser til en bredere vifte af nåle kompatibilitet, C) en præcis justeringsmekanisme for nål til dyse positionering, og D) at integrere yderligere indgange og mikrofluidisk enheder til på flue materiale forberedelse.
Hydro gel optimering
For at bestemme den optimale ALG: CMC ratio, blev flere materiale iterationer evalueret. Generelt blev kerne/Shell-udskrivning med koncentrationer over 3 WT .% af begge komponenter umuliggjort, fordi det ikke tillod en kontinuerlig hydrogel-strøm eller resulterede i tilstopning af dysen. Specifikt øgede ALG-koncentrationen over 3 WT .% viskositeten for meget og resulterede i tilstopning af dyser, mens lavere ALG-koncentrationer og højere CMC-koncentrationer (> 3 WT .%) aftog tværgående tider og dermed undlod at give tilstrækkelige strukturel støtte til stilladset. Core/Shell udskrivning var muligt med mindre viskøse formuleringer; ekstruderet gel viskositet skal dog være tilstrækkeligt til at opretholde langsigtet form troskab. I sidste ende, en 1:1 ALG: CMC ratio blev vist sig at være den mest egnede valg, som bekræfter en tidligere undersøgelse af maver et al.49. Tilføjelsen af NFC væsentligt forbedret print barhed og strukturel stivhed af kerne/Shell trykte stilladser, men havde ingen signifikant effekt på tværgående egenskaber af materialet.
Brugerdefinerede applikationer, optimeret til specifikke celletyper og eksperimentelle set-ups vil kræve velskrædder syede stilladser materialer, som vil variere i sammensætning og Cross-Linking mekanismer. Den metode, der er beskrevet i dette arbejde, er baseret på en blandet polymeropløsning af alginat-cellulose, som er kryds forbundet ionisk ved hjælp af ca2 + ioner. Alginat er en lineær polymer af blokke af (1, 4)-linkede β-d-mannuronat (M) og α-l-guluronat (G) rester, der kan reversibelt ionisk tværbundet ved anvendelse af ca2 + og andre Divalente kationer såsom SR2+, br2 +, mg 2 +. Ikke desto mindre er den mest udbredte ion for tværbinding af alginat fortsat ca2 + i form af CaCl2. Ca2 + kan også anvendes i form af Caso4 eller CaCO3; men den lave Opløselighed af CaSO4 i forhold til CaCl2 betyder langsommere gelation. CaCO3 giver endnu langsommere gelationstid, hvilket kan resultere i svage og inkonsekvente mekaniske egenskaber.
Længere gelationstid typisk producere en mere homogen konstruktion, dog, visse applikationer, såsom Core/Shell udskrivning kræver hurtige gelering satser50. Mg2 + ioner inducerer også gelation; men deres Cross-Linking effektivitet er omkring 5x-10x lavere, sammenlignet med ca2 +, med Cross-Linking tider på 2-3 h. Desuden er magnesiumioner mere selektive mod guluroniske enheder, og derfor afhænger tvær koblingen mere af den kemiske sammensætning af ALG51. I dette tilfælde er en hurtig gelering sats afgørende for at sikre kontinuerlig hule kanal dannelse, før den hule struktur kan kollapse. CaCl2 giver den hurtigste gelering sats, som er afgørende for direkte aflejring af hule filamenter. 100 mM CaCl2 blev udnyttet, hvilket i tilstrækkelig grad stabiliserede den kontinuerlige dannelse af en hul glødetråd uden at forårsage gel størkning i dysen.
Trykning og efter behandling af stilladser
Følgende trin bør overvejes i denne del af processen, herunder 1) sikre, at alle opløsninger og materialer, herunder 3D bioprinter, er korrekt steriliseret inden udskrivning. 2) når hydrogel forberedes, er homogeniteten af materialet afgørende for kontinuerlig udskrivning. Det bør undgås at indføre urenheder eller luftbobler, da de kan tilstoppe dysen og/eller forstyrre ekstrudering. 3) sprøjterne skal være korrekt forbundet til kerne/Shell dysen via luer-Lock mekanismen og korrekt indsat i ekstruders mounts, som det ses i figur 2a, B. 4) før du udskriver en kompleks struktur, anbefales det at pre-Ekstruderer en lille del af gelen og Cross-Linking-opløsningen for at rydde de overskydende luftbobler i kernen/Shell dysen og sikre en kontinuerlig hydrogel flow. Dette kan inkorporeres direkte i g-koden for at forbedre gentagelses evnen. 5) det er nyttigt at tilføje en nederdel omkring stilladset for at sikre udlægning af en homogen hule glødetråd, før trykning af stilladset selv starter.
Derudover, 6) for at forbedre vedhæftningen mellem udskrifts glødetråden og substratet, anbefales det at bruge en flad overflade med god vedhæftning (dvs. en glas rutsjebane eller Petri skål). 7) ekstruderingdysen bør ikke være i direkte kontakt med substratet for at muliggøre uafbrudt strøm af hydrogel. Den indledende afstand vil i høj grad påvirke kvaliteten af print, men tykkelsen af ekstruderet glødetråd er en god tilnærmelse af den oprindelige indstilling. 8) start udskrivnings højden i g-koden skal justeres efter individuelle behov. Når udskrivnings parametrene er optimeret, skal stilladset g-koden importeres til Planet CNC-software, og udskrivningsprocessen startede som beskrevet i protokollen. 9) for at kontrollere og optimere hydrogel flow med det formål at udskrive optimale stilladser, bør både formulerings sammensætning og udskrivningsparametre varieres (dvs. udskrivningshastighed, ekstruderingtryk, udskrivnings temperatur, afstand mellem substrat og ekstruderingdyse, laghøjde, stillads størrelse osv.).
Generelt kræves højere strømningshastigheder for at udskrive formuleringer med højere viskositet. Som nævnt giver alle hydrogel formuleringer, som er egnede til umiddelbar kemisk tværbinding, mulighed for et-trins fabrikation af hule slanger og kan anvendes med den beskrevne kerne/Shell-opsætning. De print og Cross-Linking mekanismer skal optimeres i overensstemmelse hermed. Efter udskrivningen var alle stilladser blevet efterbehandlet ved sekundær tværbinding med 5 WT .% CaCl2 -opløsning, som sikrede fuldstændig tværbinding af ALG-CMC-komponenten og steriliseret fra begge sider under et UV-lys i mindst 30 minutter. Det bør sikres helt at opsluge stilladset med Cross-Linking-opløsningen og inkubere længe nok til at gennemføre tværgående sammenkædningen. Efter behandlingen vil variere afhængigt af den anvendte materiale-og krydsliningsmekanisme, som bør overvejes på forhånd. Efter behandling skal stilladser fjernes forsigtigt fra substratet, overføres til cellekultur medier og inkuberet i en kontrolleret atmosfære i mindst 24 timer før celle såning. Brug af et farveløse medium vil forbedre synligheden af cellesuspensionen under injektion i stilladser.
Levende/dødt assay
Den levende/døde opløsning skal tilberedes direkte før udførelse af analysen og holdes i mørke før udførelse af analysen, da den indeholder fluorescens farvestoffer, der er tilbøjelige til at blege. Efter den ønskede inkubationstid skal cellekultur medierne omhyggeligt kasseres omkring stilladser og skylles med PBS. Ideelt bør det samme indgangspunkt anvendes til celle såning efterfulgt af den levende/døde analyse, der injiceres i stilladser.
Resultatenes betydning
Både ALG og CMC er allerede blevet brugt til at fremme angiogenese in vitro. Baseret på sine ECM-mimetic funktioner, fysisk Cross-Linking, og biokompatibilitet, har ALG været almindeligt anvendt som en komponent til levering og kontrolleret frigivelse af angiogeniske vækstfaktorer (f. eks bFGF, HGF, VEGF164, og Ang-1 * henholdsvis)52 ,53,54. Desuden er CMC i kombination med gelatine også blevet anvendt til indkapselse af vaskulære endotelceller på grund af dets hurtigt tværgående egenskaber under fysiologiske forhold55. NFC blev tilføjet for yderligere at øge den mekaniske stabilitet og form troskab af stilladser. Det skal understreges, at målet ikke var at forbedre vaskulariseringen, men at demonstrere muligheden for at producere perfbrugbart, hule ALG-CMC stilladser, trykt i kerne/Shell mode, som også letter fastgørelse og spredning af HUVECs. Valget af at bruge en ALG-CMC-blanding var baseret på fund af almindeligt anvendte, lettilgængelige og biokompatible basismaterialer, der kunne muliggøre kerne-/Shell-udskrivning af hule kanaler. Mange andre materialer kan være mere levedygtige muligheder for at øge angiogenesis; men nogle er ikke egnet til kerne/Shell trykning, da de ikke letter hurtig gelation/Cross-Linking, hvilket er afgørende i denne tilgang.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende den finansielle støtte til dette projekt modtaget fra det slovenske forskningsagentur (tilskuds numre: P3-0036 og I0-0029) og ministeriet for videnskab, uddannelse og sport (tilskudsnummer: 5442-1/2018/59).
Alginic acid sodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | 180947 | powder; Mw ~80,000 |
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] | LGC Standards (UK) | ATCC-CRL-1730 | Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings. |
Axiovert 40 inverted optical microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) | three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Germany) | C1016 | anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0% |
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) | The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) | nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns | |
ELGA Purelab water purification system | Veolia Water Technologies (UK) | ||
EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | AMF4300 | a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications |
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 12491015 | high glucose; no glutamine; phenol red |
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 21063029 | high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red |
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 10270106 | FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS |
Hypodermic Sterican needle | B. Braun Melsungen AG (Germany) | 9180117 | 0.40 x 25mm, 27G x 1'' |
L-glutamine | Sigma-Aldrich (Germany) | G3126 | ReagentPlus®, ≥99% (HPLC) |
Live/Dead Cell Double Staining Kit | Sigma-Aldrich (Germany) | 4511 | contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence |
Nunc EasYFlask cell culture flasks | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 156367 | Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2 |
Omnifix syringe | B. Braun Melsungen AG (Germany) | 4617053V | 5 mL Luer Lock |
Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | P3032 | powder; BioReagent; suitable for cell culture |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich (Germany) | P4417 | tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C |
Sodium carboxymethyl cellulose | Sigma-Aldrich (Germany) | 419338 | powder; average Mw ~700,000 |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Germany) | S9137 | powder; BioReagent; suitable for cell culture |
Ultra-pure water | Veolia Water Technologies (UK) | 18.2 mΩ cm at 25⁰C | |
VitaPrint 3D bio-printer | IRNAS (Slovenia) |