Identifizieren von Mutationen durch hochauflösendes Schmelzen in einer TILLING-Bevölkerung von Reis
Summary
In diesem Artikel stellen wir das Protokoll vor, das als HRM-basiertes Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) beschrieben wird. Diese Methode nutzt Fluoreszenzänderungen beim Schmelzen des DNA-Duplex und eignet sich für das Hochdurchsatz-Screening sowohl der Insertion/Deletion (Indel) als auch der Single Base Substition (SBS).
Abstract
Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) ist eine Strategie der Reverse-Genetik für das Hochdurchsatz-Screening von induzierten Mutationen. Das TILLING-System ist jedoch weniger anwendbar für die Insertion/Deletion (Indel)-Erkennung und herkömmliche TILLING-Schritte benötigen komplexere Schritte, wie cel I Nuklease-Verdauung und Gelelektrophorese. Um den Durchsatz und die Selektionseffizienz zu verbessern und das Screening sowohl von Indels als auch von Single Base Substitions (SBSs) zu ermöglichen, wird ein neues HIGH-Resolution-Melting-System (HRM) entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes HRM-TILLING Protokoll vor und zeigen dessen Anwendung im Mutationsscreening. Diese Methode kann die Mutationen von PCR-Amplicons analysieren, indem die Denaturierung von doppelsträngiger DNA bei hohen Temperaturen gemessen wird. Die HRM-Analyse erfolgt direkt nach der PCR ohne zusätzliche Verarbeitung. Darüber hinaus ist eine einfache, sichere und schnelle (SSF) DNA-Extraktionsmethode in HRM-TILLING integriert, um sowohl Indels als auch SBSs zu identifizieren. Seine Einfachheit, Robustheit und hoher Durchsatz machen es potenziell nützlich für Mutationsscans in Reis und anderen Kulturen.
Introduction
Mutanten sind wichtige genetische Ressourcen für die pflanzenfunktionelle Genomforschung und die Züchtung neuer Sorten. Ein Forward-Genetik-Ansatz (d.h. von der mutierten Selektion bis zum Genklonen oder der Sortenentwicklung) war vor etwa 20 Jahren die wichtigste und einzige Methode für die Verwendung induzierter Mutationen. Die Entwicklung einer neuartigen Reverse-Genetik-Methode, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) von McCallum et al.1 eröffnete ein neues Paradigma und wurde seitdem bei einer großen Anzahl von Tier- und Pflanzenarten angewendet2. TILLING ist besonders nützlich für Zuchteigenschaften, die technisch schwierig oder kostspielig zu bestimmen sind (z. B. Krankheitsresistenz, Mineralgehalt).
TILLING wurde ursprünglich für Screening-Punktmutationen entwickelt, die durch chemische Mutagene induziert werden (z.B. EMS1,3). Sie umfasst die folgenden Schritte: die Einrichtung einer TILLING-Bevölkerung; DNA-Vorbereitung und -Pooling einzelner Pflanzen; PCR-Verstärkung des Ziel-DNA-Fragments; Heteroduplexe Bildung durch Denaturierung und Glühen von PCR-Amplicons und Spaltung durch CEL I Nuklease; und Identifizierung mutierter Individuen und ihrer spezifischen molekularen Läsionen3,4. Diese Methode ist jedoch nach wie vor relativ komplex, zeitaufwändig und mit geringem Durchsatz. Um es effizienter und mit höherem Durchsatz zu machen, wurden viele modifizierte TILLING-Methoden entwickelt, wie z.B. Löschen TILLING (De-TILLING) (Tabelle 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
Die HRM-Kurvenanalyse, die auf Fluoreszenzänderungen beim Schmelzen des DNA-Duplexs basiert, ist eine einfache, kostengünstige und hochdurchsatzstarke Methode für Mutationsscreening und Genotypisierung13. HRM wurde bereits weit verbreitet in der Pflanzenforschung einschließlich HRM-basierteTILLING (HRM-TILLING) für das Screening von SBS-Mutationen durch EMS-Mutagenese14induziert. Hier präsentierten wir detaillierte HRM-TILLING-Protokolle zum Screening von Mutationen (sowohl Indel als auch SBS), die durch Gamma-Strahlen im Reis induziert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING hat sich als ein leistungsfähiges reverse genetisches Werkzeug zur Identifizierung induzierter Mutationen für die Genfunktionalanalyse und Pflanzenzüchtung erwiesen. Für einige Merkmale, die nicht leicht beobachtet oder bestimmt werden können, kann TILLING mit PCR-basierter Mutationsdetektion mit hohem Durchsatz eine nützliche Methode sein, um Mutanten für verschiedene Gene zu erhalten. Die HRM-TILLING-Methode wurde in EMS-mutagenisierten Populationen von Tomaten12,Weizen<sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (Nr. 2016YFD0102103) und der National Natural Science Foundation of China (Nr.31701394) unterstützt.
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
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