Denne protokol beskriver en tilgang til fremstilling af hepatokugler fra humane pluripotente stamceller ved hjælp af et defineret kultur system og celle selvsamling. Denne protokol er reproducerbar i en række cellelinjer, omkostningseffektiv og giver mulighed for produktion af stabile humane hepatospheres til biomedicinsk anvendelse.
Udviklingen af vedvarende kilder til levervævet er nødvendig for at forbedre celle-baserede modellering, og udvikle humant væv til transplantation. Humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSCs) repræsenterer lovende kilder til menneskelige lever kugler. Vi har udviklet en serum fri og defineret metode til cellulær differentiering til at generere tredimensionelle menneskelige lever kugler dannet af humane pluripotente stamceller. En potentiel begrænsning af teknologien er produktionen af tætte kugler med dødt materiale indeni. For at omgå dette har vi ansat agopstået strips med mikrobrønde-teknologi på definerede celle tætheder til at kontrollere størrelsen af 3D-sfærerne, hvilket forhindrer generering af apoptotiske og/eller nekrotiske kerner. Især de sfærer genereret af vores tilgang viser leverfunktion og stabil fænotype, der repræsenterer en værdifuld ressource for grundlæggende og anvendt videnskabelig forskning. Vi mener, at vores tilgang kunne bruges som en platform teknologi til at udvikle yderligere væv til at modellere og behandle sygdomme hos mennesker og i fremtiden kan tillade generering af humant væv med komplekse væv arkitektur.
Menneskelige pluripotente stamcellernes evne til at forny sig selv, samtidig med at pluristyrken bevares, giver mulighed for at producere humane celletyper og væv efter behov. hpscs er blevet effektivt differentieret i hepatocyte-lignende celler (hlcs) ved hjælp af to-dimensionelle (2D) overholder kultur systemer1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Disse systemer er blevet anvendt til succesmodel monogen sygdom, virus livscyklus, Drug induceret leverskade (DILI), føtal udsættelse for toksiner og ikke-alkoholiske fedt leversygdom (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Men disse modeller besidder nogle ulemper, som begrænser deres rutine brug. Disse omfatter føtal markør udtryk, ustabil fænotype og dårlig vævs arkitektur16,17,18,19, som også kunne begrænse ekstrapolation til organfunktion in vivo.
For at overvinde disse begrænsninger, tre-dimensionelle (3D) differentiering platforme er blevet udviklet til at efterligne in vivo væv arkitektur. Selv om disse tilgange gør det muligt, er afhængige af brugen af animalske afledte produkter og matricer til at drive vævs Genesis20,21,22, begrænse opskalering og udbredt anvendelse.
Her har vi detaljerede procedurer for at generere store mængder af 3D-hepatokugler fra hPSCs ved hjælp af definerede materialer og celle selvsamling. Især væv genereret af vores procedure forbliver funktionel i mere end et år i cellekultur og er i stand til at understøtte leverfunktion in vivo23.
Sammenfattende giver vores definerede differentierings metode mulighed for at fremprovokere stabile humane hepatotoksfærer fra både humane embryonale stamceller (hESCs) og inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Vi mener, at den beskrevne procedure repræsenterer et betydeligt gennembrud i produktionen af 3D-hepatospheres til grundlæggende og anvendt videnskabelig forskning.
Udviklingen af definerede og Xeno-fri systemer til at producere humane hepatspheres i 3D er nødvendig for både in vitro og in vivo bestræbelser. På nuværende tidspunkt de fleste hepatocyt differentiering tilgange fra humane pluripotente stamceller udføres i to dimensionelle tilhængere kulturer. Disse miljøer mangler mange af de miljømæssige signaler involveret i væv Genesis og homøostase, som omfatter; Heterotypiske celle interaktioner, matrix produktion og Remodeling, hvilket resulterer i dårlig oversættelse til in vivo biologi18,19.
Som et resultat, forskning har fokuseret på alternative tilgange til at generere hepatospheres fra pluripotente stamceller. En række 3D-undersøgelser har fremmet marken, men de er afhængige af animalske produkter20,22,24 for at yde støtte og/eller kræve anvendelse af humant væv21,22 hvilket komplicerer teknologi opskalering og kompromitterer eksperimentel reproducerbarhed og anvendelse.
Den procedure, der er beskrevet i vores artikel (figur 1), er defineret, effektiv, meget reproducerbar og omkostningseffektiv, hvilket gør det muligt at fremstille funktionelle lever kugler, som forbliver funktionelle over et år in vitro og giver kritisk lever støtte i vivo14. Vigtigere, denne platform giver brugeren mulighed for at kontrollere størrelsen af 3D leveren kugler, begrænse dannelsen af tætte nekrotiske Centre og tab af phenotype.
Overførslen af 3D-hepatosfærerne til poly-HEMA-belagte plader udgør et kritisk skridt i denne protokol. Det er vigtigt at pipetten forsigtigt på dette trin i proceduren for at undgå at beskadige kuglen. Desuden skal medieændringer udføres omhyggeligt for at undgå forskydnings stress og forvrængning af kugle strukturen.
I disse undersøgelser, 3D hepatospheres vist en organiseret struktur (figur 2 og figur 3), cytochrom P450 funktion (figur 4) og udskilles lever proteiner, herunder albumin og alpha-fetoprotein (figur 5). Denne procedure er blevet udført med succes i fire pluripotente stamceller linjer med sammenlignelige resultater. Når man ser fremad, kan denne teknologi anvendes som en platform til at udvikle yderligere epitel og mesenchymal væv med komplekse arkitekturer.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet med priser fra den britiske regenerative Medicine platform (MRC MR/L022974/1) og den ledende videnskabsmands kontor (TCS/16/37).
Cell Culture and functional assays | |||
Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Equipment | |||
Microwave | Bosch | ||
Microtome | Leika | RM2125RT | |
Oven | Thermoscientific | ||
Antibodies | |||
Primary antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |