Presentert her er en optimalisert protokoll for å isolere, dyrking, transfecting, og differensiere menneskets primære monocytter fra HIV-smittede individer og sunne kontroller.
Humant immunsviktvirus (HIV) er fortsatt en stor helse bekymring til tross for innføringen av kombinert antiretroviral behandling (cART) på midten av 1990-tallet. Mens antiretroviral behandling effektivt senker systemisk viral belastning og gjenoppretter normal CD4+ T celle tellinger, betyr det ikke Rekonstituer en helt funksjonell immunsystem. En dysfunksjonelle immunsystem i HIV-infiserte individer under cART kan være preget av immun aktivering, tidlig aldring av immunceller, eller vedvarende betennelse. Disse forholdene, sammen med komorbide faktorer forbundet med HIV-smitte, legger kompleksiteten til sykdommen, som ikke kan lett gjengis i cellulære og dyremodeller. For å undersøke den molekylære hendelser underliggende immun dysfunksjon hos disse pasientene, et system til kultur og manipulere menneskelig primære monocytter in vitro er presentert her. Nærmere bestemt, tillater protokollen for kultur og transfeksjoner av primære CD14+ monocytter innhentet fra HIV-infiserte individer gjennomgår cART så vel som fra HIV-negative kontroller. Metoden innebærer isolasjon, kultur, og transfeksjoner av monocytter og monocytt-avledede makrofager. Mens kommersielt tilgjengelige kits og reagenser er ansatt, gir protokollen viktige tips og optimaliserte vilkår for vellykket overholdelse og transfeksjoner av monocytter med miRNA og hemmere, så vel som med siRNAs.
Humant immunsviktvirus-1 (HIV-1) infeksjon forårsaker alvorlig immun dysfunksjon, som kan føre til opportunistiske infeksjoner og ervervet immunsviktsyndrom (AIDS). Selv om HIV-smittede pasienter under cART er preget av lav viral belastninger og normal CD4+ T Cell teller, funksjon av immunsystemet kan bli kompromittert i disse individene, som fører til en dysfunksjonelle immunrespons som har vært knyttet til en økt risiko for å utvikle kreft1. Mekanismene for immun dysfunksjon i HIV-pasienter i handlevognen fortsatt i stor grad ukjent. Derfor karakteriserer pasient-avledet immunceller og gransker deres biologi og funksjon er en kritisk komponent i dagens HIV-forskning.
Monocytter og makrofager er sentrale regulatorer av immunresponser og spille grunnleggende roller i HIV-smitte2,3,4,5. Heterogen og plast i naturen, makrofager kan grovt klassifiseres i klassisk aktivert (M1) eller alternativt aktivert (M2). Mens denne generelle klassifiseringen er nødvendig når du setter opp eksperimentelle vilkår, polarisering status av makrofager kan reverseres av en rekke cytokiner6,7,8,9. Selv om flere studier har undersøkt virkningene av HIV-smitte på monocytter og dendrittiske celler, molekylære detaljer om monocytt-mediert svar er i stor grad ukjent6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Blant de faktorene som er involvert i immun celle regulering og funksjon, microRNAs (miRNAs), kort ikke-koding RNAs at post-transcriptionally regulere genuttrykk, har vist seg å spille en viktig rolle i sammenheng med store cellulære veier (dvs. vekst, differensiering, utvikling, og apoptose)20. Disse molekylene har blitt beskrevet som viktige regulatorer av transkripsjon faktorer avgjørende for å diktere funksjonell polarisering av makrofager21. Den potensielle rollen til miRNAs i monocytter fra HIV-infiserte individer gjennomgår handlevognen har blitt undersøkt, men fremgangen i feltet krever mye mer arbeid22,23,24,25,26. Dette papiret diskuterer en optimalisert metode for å transfect miRNAs og siRNAs i primære menneskelige monocytter fra HIV-infiserte pasienter og kontroller.
Denne protokollen er avhengig av kommersielt tilgjengelige reagenser og sett, som kontinuitet i den tekniske prosedyren bidrar til å eliminere unødvendige eksperimentelle variabler når du arbeider med kliniske prøver. Likevel gir metoden viktige tips (dvs. antall celler belagt eller kort inkubasjons med serum-frie medier for å fremme overholdelse av celler til platen). I tillegg er polarisering forholdene som brukes i denne protokollen avledet fra publisert arbeid27,28,29.
Den presenterte protokollen demonstrerer bruk av primær celler fra HIV-smittede som en modell for å studere monocytter og makrofager. HIV+ pasienter gjennomgår cART leve med infeksjon i flere år og kan også ha andre co-infeksjoner knyttet en kompromittert immunsystem. Å studere immunomodulation i nærvær av HIV kronisk infeksjon, celler ble høstet fra pasienter direkte. Som miRNAs har vist å spille store roller i celle utvikling og differensiering, fokuserer protokollen på evnen til å manipulere miR…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke HIV Clinical/tumor Biorepository Core for å gi pasienten prøver og Cellular immunologi metabolisme Core for å gi flyt flowcytometri analyse. Dette prosjektet ble finansiert av NIH P20GM121288 og P30GM114732.
0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
PBS | Gibco | 20012027 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |