Parasponia andersonii är ett snabbväxande tropiskt träd som tillhör cannabis familjen (Cannabaceae) och kan bilda kvävefixerande rotknölar i samband med Rhizobium. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för omvänd genetiska analyser i P. andersonii baserat på Agrobacterium tumefaciens-medierad stabil transformation och CRISPR/Cas9-baserad genom redigering.
Parasponia andersonii är ett snabbväxande tropiskt träd som tillhör cannabis familjen (Cannabaceae). Tillsammans med 4 ytterligare arter, det utgör den enda kända icke-balen härstamning kunna etablera en kvävefixerande knöl symbios med Rhizobium. Jämförande studier mellan baljväxter och P. andersonii kan ge värdefull insikt i de genetiska nätverk underliggande rot knöl bildas. För att underlätta jämförande studier, sekvenserade vi nyligen P. andersonii genom och etablerade Agrobacterium tumefaciens-medierad stabil transformation och CRISPR/Cas9-baserad genom redigering. Här ger vi en detaljerad beskrivning av omvandling och genomredigering förfaranden som utvecklats för P. andersonii. Dessutom beskriver vi procedurer för utsäde grobarhet och karakterisering av symbiotiska fenotyper. Med hjälp av detta protokoll kan stabila transgena muterade linjer genereras under en period av 2-3 månader. Vegetativt in vitro-spridning av T0 transgena linjer gör det möjligt att inleda fenotypnings experiment vid 4 månader efter en. tumefaciens samodling. Därför tar detta protokoll bara marginellt längre än den övergående Agrobacterium rhizogenes-baserade rotomvandlings metod tillgänglig för P. andersonii, men erbjuder flera tydliga fördelar. Tillsammans, de förfaranden som beskrivs här tillåter P. andersonii att användas som en forskningsmodell för studier som syftar till att förstå symbiotiska föreningar samt potentiellt andra aspekter av biologi i detta tropiska träd.
Parasponia andersonii är ett tropiskt träd tillhörande cannabis familjen (Cannabaceae) och är infödd till Papua Nya Guinea och flera Stillahavsöarna1,2,3. Tillsammans med 4 ytterligare Parasponia arter, den representerar den enda icke-balanser härstamning som kan etablera en kvävefixerande knöl symbios med Rhizobia. Denna symbios är väl studerat i baljväxter (Fabaceae) modeller Medicago minor och Lotus japonicus, vilket har resulterat i att förvärva detaljerad kunskap om den molekylära genetiska karaktären av knöl bildas och fungerande4. Dessutom, det visades att roten knöl symbios i baljväxter grundas på mycket äldre, och utbredd arbuskulära bildar mykorrhiza symbios5. Phylogenomic jämförelser tyder på att kvävefixerande knöl symbioser av baljväxter, Parasponia, liksom, den så kallade actinorhizal växtarter som värd diazotrofiska frankia bakterier, har en gemensam evolutionära ursprung 6,7,8. För att avgöra om de gener som identifierats vara inblandade i balannodule bildas är en del av en bevarad genetisk grund, studier på icke-balanväxter arter är viktiga. För detta ändamål föreslår vi att använda P. andersonii som en jämförande forskningsmodell, tillsammans med baljväxter, för att identifiera de centrala genetiska nätverk underliggande rot knöl bildas och fungerar.
P. andersonii är en pionjär som finns på sluttningarna av vulkaniska kullar. Den kan möta tillväxthastigheter på 45 cm per månad och nå längder på upp till 10 meter9. P. andersonii träd är vind-pollineras, som underlättas av bildandet av separata manliga och kvinnliga blommor3,10. Vi sekvenserade nyligen och kommenterade diploida arvsmassan (2n = 20; 560 MB/1C) av P. andersonii, och monterade utkast till genomsekvenser av ytterligare två parasponia -arter; P. rigida och p. rugosa6. Detta avslöjade ~ 35 000 P. andersonii gen modeller som kan klustras i > 20000 ortogrupper tillsammans med gener från M. minor, sojabönor (Glycine max), Arabidopsis thaliana, Woodland Strawberry ( Fragaria smultron), trema orientalis, svart bomull poppel (Populus trichocarpa) och eucalypt (Eucalyptus grandis)6. Dessutom, transkriptome jämförelser mellan M. minor och P. andersonii identifierade en uppsättning 290 förmodade orthologues som visar en nodule-förstärkt uttryck mönster i båda arterna6. Detta ger en utmärkt resurs för jämförande studier.
För att studera gen funktionen i P. andersonii rötter och noduli, ett protokoll för Agrobacterium rhizogenes-medierad rot omvandling har upprättats11. Med hjälp av detta protokoll, sammansatta växter som bär transgena rötter kan genereras i en relativt kort tidsram. Denna metod är, också, allmänt tillämpas i balen-symbios forskning12,13,14. Nackdelen med denna metod är dock att endast rötter omvandlas och att varje transgen rot representerar en oberoende transformationshändelse, vilket resulterar i betydande variation. Omvandlingen är också övergående och transgena linjer kan inte upprätthållas. Detta gör en. rhizogenes-baserad rot omvandling mindre LÄMPAD för CRISPR/Cas9-medierad genom redigering. Dessutom, A. rhizogenes överför sin rot inducerande Locus (ROL) gener till växtgenomet, som en gång uttryckte störa hormon homeostas15. Detta gör att studera rollen av växthormoner i A. rhizogenes-transformerade rötter utmanande. För att övervinna dessa begränsningar, vi nyligen utvecklat ett protokoll för Agrobacterium tumefaciens-baserad omvandling och CRISPR/Cas9-medierad mutesis av P. andersonii10.
Här ger vi en detaljerad beskrivning av a. tumefaciens-baserade omvandlings procedur och omvänd genetik pipeline utvecklad för P. andersonii. Dessutom tillhandahåller vi protokoll för nedströms hantering av transgena plantlets, inklusive analyser för att studera symbiotiska interaktioner. Med hjälp av protokollet som beskrivs här, kan flera transgena linjer genereras i en 2-3 månaders period. I kombination med CRISPR/Cas9-medierad mutagenes, detta möjliggör effektiv generering av knockout Mutant linjer. Dessa Mutant linjer kan vegetativt förökas in vitro-10,16,17, vilket gör att tillräckligt material som skall genereras för att starta fenotypisk karakterisering vid 4 månader efter omvandlingsförfarandet har inletts10. Tillsammans, denna uppsättning förfaranden bör tillåta varje labb att anta P. andersonii som en forskningsmodell för studier som syftar till att förstå rhizobial och bildar mykorrhiza föreningar, samt potentiellt andra aspekter av biologi i denna tropiska träd.
Baljväxter och det avlägset besläktade Cannabaceae släktet parasponia representerar de enda två kladerna av växtarter som kan etablera ett endosymbiotiskt förhållande med kvävefixerande former och rotknölar. Jämförande studier mellan arter av båda kladerna är mycket relevanta för att ge insikter i de centrala genetiska nätverk som möjliggör denna symbios. För närvarande, genetiska studier görs främst i baljväxter; speciellt de två modell arterna M. minor och L. japonicus. För att ge en ytterligare experimentell plattform och underlätta jämförande studier med en nodulating icke-balanväxter, beskriver vi här ett detaljerat protokoll för stabil omvandling och omvänd genetiska analyser i P. andersonii. Det presenterade protokollet använder in vitro-spridning av T0 transgena P. andersonii -linjer, vilket gör det möjligt att inleda fenotypisk analys inom 4 månader efter samodling av A. tumefaciens . Detta är betydligt snabbare än nuvarande protokoll som har fastställts för stabil omvandling av baljväxter33. Detta gör P. andersonii en attraktiv forskningsmodell.
Det protokoll som beskrivs här innehåller flera kritiska steg. Den första gäller utsäde grobarhet. För att förbereda P. andersonii frön för grobarhet, frön måste isoleras från bären. Detta görs genom att gnugga Bären på en bit av silkespapper eller mot insidan av en tesil. Detta förfarande måste utföras försiktigt för att förhindra skador på utsäde pälsen. Om frö pälsen blir skadad, kan blekmedel in i utsäde under sterilisering, vilket minskar utsäde lönsamhet. För att bryta utsäde dormancy, frön utsätts för en 10-dagars temperaturcykel. Men trots denna behandling är grobarheten inte helt synkroniserad. Generellt, de första fröna visar rot uppkomst efter 7 dagar, men andra kan ta flera dagar längre tid att gro.
Kritiska punkter i omvandlingsförfarandet gäller valet av utgångsmaterial och varaktigheten av samodling steg. För att uppnå effektiv omvandling, är det bäst att använda friska och unga stammar eller bladskaft av icke-sterila växthusodling växter som utgångsmaterial. För att inducera tillväxten av unga grenar, är det tillrådligt att trimma Parasponia träd varje 2-3 månader och uppdatera träd en gång om året. Dessutom måste samodling steg endast utföras för 2 dagar. Långvarig samodling främjar över-kolonisering av vävnad djur av A. tumefaciens och i allmänhet minskar omvandlings effektiviteten. För att förhindra överkolonisering av A. tumefaciens är det också viktigt att regelbundet uppdatera plattorna på vilka djur odlas. I fall överkolonisering inträffar, vävnad djur kan tvättas (se avsnitt 3,8) för att ta bort A. tumefaciens celler. Vi rekommenderar att lägga blekmedel till SH-10 lösning som används för tvättning (slutlig koncentration: ~ 2% hypoklorit). Det är viktigt att notera att detta ytterligare tvättsteg kanske inte fungerar på tungt smittade djur (figur 2b). Om en omvandling med en CRISPR/Cas9-konstruktion ger endast ett begränsat antal putsat-transformerade skott eller om mutagenes av en viss gen förväntas orsaka problem i regenerering, är det tillrådligt att inkludera en tom vektor kontroll konstruktion som den positiva kontrollen. Slutligen är det viktigt att se till att alla transgena linjer som väljs är resultatet av oberoende T-DNA-integrationsevenemang. Därför instruerar vi att ta bara en enda putatively-transgena skjuta från varje sida av en explant. Vi inser dock att detta minskar det potentiella antalet oberoende linjer. Om många linjer krävs, kan forskarna besluta att separera putatively omvandlad Calli från den ursprungliga djur när dessa Calli är ≥ 2 mm i storlek och kultur dessa Calli självständigt. På detta sätt kan flera linjer isoleras från varje explant, vilket höjer antalet potentiella transgena linjer.
I det aktuella protokollet sprids transgena linjer av P. andersonii vegetativt genom in vitro-spridning. Fördelen med detta är att många transgena plantlets kan genereras i en relativt kort tidsperiod. Men denna metod har också flera begränsningar. För det första är upprätthållandet av T0 transgena linjer genom in vitro-spridning arbetsintensiva och kan resultera i oönskade genetiska eller epigenetiska förändringar34,35. För det andra, T0 linjer innehåller fortfarande en kopia av t-DNA, inklusive antibiotikaresistens kassetten. Detta begränsar antalet möjliga omtransformeringar, eftersom olika markerings markörer krävs för varje omomvandling. För närvarande har vi bara testat omvandling med kanamycin eller hygromycin urval (data som inte visas). Dessutom komplierar närvaron av Cas9-kodningssekvensen och sgRNAs i T0 transgena linjer kompletterings studier. Kompletterings analyser är möjliga men kräver att sgRNA målwebbplats (er) muteras som sådan att genredigering av komplemen konstruktionen förhindras. För det tredje, en nackdel med att arbeta med T0 linjer är att CRISPR/Cas9 mutanter kan vara chimeric. För att förhindra fenotypisk analys av chimär Mutant linjer, rekommenderar vi att upprepa genotypning analys efter in vitro-spridning på minst 3 olika skott. Även om antalet chimär mutanter som erhållits med hjälp av protokollet som beskrivs här är begränsad, de är ibland observeras10. För att övervinna begränsningarna av att arbeta med T0 linjer, P. andersonii Mutant linjer kan spridas Generativt. P. andersonii träd är tvåbyggare och vind-pollinerade2. Detta innebär att varje transgen linje måste manipuleras så att manliga och kvinnliga blommor produceras på en enda individ, och därefter odlas som sådan att kors pollinering inte förekommer. Som P. andersonii är ett snabbväxande träd det kräver en stor mängd utrymme i ett tropiskt växthus (28 ° c, ~ 85% relativ fuktighet). Därför, även om det är tekniskt möjligt, generativ utbredning av P. andersonii transgena linjer är logistiskt utmanande.
I protokollet avsnitt, beskrev vi 3 metoder för nodulationen av P. andersonii. Fördelen med plattan och påsen system är att rötterna är lättillgängliga, vilket kan tillåta spot-inympning av bakterier och efter knöl bildas över tiden. Men plattan systemet är ganska arbetsintensiva, vilket gör det mindre lämpad för storskaliga nodulationen experiment. En nackdel med påsen systemet är att det är svårt att förhindra svampangrepp. Påsar är inte sterila, och därför svamp tillväxt observeras ofta på den övre halvan av påsen. Emellertid, detta påverkar inte P. andersonii tillväxt, och därför inte stör nodulationen analyser. Dessutom är påsen systemet endast lämplig för plantor. Trots flera försök, har vi inte kunnat odla plantlets erhålls genom in vitro-förökning i påsar.
Den P. andersonii omvänd genetik pipeline som beskrivs här erbjuder en betydande förbättring jämfört med den befintliga a. rhizogenes-baserade rot omvandling metod11. Med hjälp av de beskrivna procedurerna kan stabila transgena linjer genereras effektivt och kan upprätthållas via in vitro-spridning. I motsats, A. rhizogenes omvandling är övergående och endast resulterar i bildandet av transgena rötter. Eftersom varje transgen rot resultat från en oberoende omvandling, A. rhizogenes omvandling-baserade analyser lider av betydande fenotypisk variation. Denna variation är mycket mindre i händelse av stabila linjer, även in vitro-spridning skapar också en viss nivå av variation. På grund av denna reducerade variation och det faktum att flera plantlets skulle kunna fenotypas för varje stabil linje, är stabila linjer mer lämpade för kvantitativa analyser jämfört med A. rhizogenes-transformerade rötter. Dessutom är den stabila omvandlingen inte beroende av införandet av A. rhizogenes root inducerande Locus (ROL) som påverkar endogena hormonbalansen15. Därför är stabila linjer bättre lämpade för omvänd genetisk analys av gener involverade i hormon homeostas jämfört med A. rhizogenes-transformerade rötter. En mer allmän fördel av P. andersonii som forskningsmodell är att den inte upplever en nyligen hela genomduplicering (wgd). Den baljväxter papilionoideae under familj, som omfattar modellen baljfrukter M. minor och L. japonicus, liksom Salicaceae (Beställ Malpighiales) som innehåller modellen trädet Populus trichocarpa erfarna wgds ~ 65 miljoner år sedan36,37. Många paralogous genkopior till följd av dessa wgds behålls i genomen hos av M. minor, L. japonicus och P. trichocarpa37,38,39, vilket skapar redundans som kan komplicera omvända genetiska analyser. Som p. andersonii inte upplever en nyligen wgd, omvänd genetiska analyser på P. andersonii kan vara mindre påverkas av redundant funktion av paralogous genkopior.
Sammantaget ger vi ett detaljerat protokoll för omvänd genetisk analys i P. andersonii. Med hjälp av detta protokoll kan enstaka muterade linjer effektivt genereras inom en tidsram på 2-3 månader10. Detta protokoll kan utökas för att skapa högre ordningens mutanter genom multiplexering av sgrnas som riktar sig mot olika gener samtidigt, vilket visas för andra växtarter40,41,42. Dessutom är den stabila omvandlings procedur som beskrivs här inte begränsad till CRISPR/Cas9 gen inriktning, utan kan också användas för att introducera andra typer av konstruktioner (t. ex. för promotorn-reporter-analyser, ektopisk uttryck eller trans– komplementarisering). Vi etablerade P. andersonii som en jämförande forskningsmodell för att studera mutualistiska symbioser med kvävefixerande former eller endomycorrhizal svampar. Men de protokoll som beskrivs här ger också verktyg för att studera andra aspekter av biologi i denna tropiska träd, såsom trä formation, utveckling av bi-sexuella blommor eller biosyntesen av Cannabaceae-specifika sekundära metaboliter.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna mark youles, Sophien kamoun och Sylvestre Marillonnet för att göra Golden Gate kloning delar tillgängliga via Addgene databasen. Dessutom skulle vi vilja tacka E. James, P. Hadobas, och T. J. Higgens för P. andersonii frön. Detta arbete stöddes av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO-VICI Grant 865.13.001; NWO-Open Competition Grant 819.01.007) och Republiken Indonesiens ministerium för forskning, teknik och högre utbildning (RISET-PRO Grant 8245-ID).
Sigma-Aldrich | N0640 | NAA |
Duchefa Biochemie | M1503.0250 | MES |
Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
Duchefa Biochemie | X1402.1000 | X-Gal |
Merck | 101236 | For nucleic acid electrophoresis gel |
– | – | Pouches box material, hangers |
Merck | 101188 | NH4NO3 |
Sigma-Aldrich | B3408-1G | BAP |
Merck | 100156 | H3BO3 |
Thermo-Fisher | ER1011 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly |
Thermo-Fisher | 15561020 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Merck | 137101 | CaCl2·2H2O |
Duchefa Biochemie | C0111.0025 | C16H16N5O7S2Na |
Thermo-Fisher | K1231 | Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure |
Agronutrition | AP2011 | Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay |
Merck | 102790 | CuSO4·5H2O |
Duchefa Biochemie | D1004.1000 | Used for plant tissue culture agar-based medium |
Merck | 105101 | K2HPO4 |
VWR Chemicals | 20302.293 | Na2·EDTA |
Duchefa Biochemie | M0803.1000 | C6H14O6 |
Thermo-Fisher | ER0291 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly |
Merck | 100983 | C2H5OH |
VWR Chemicals | BDH9232-500G | EDTA |
Sigma-Aldrich | Z377600-1PAK | Cellophane membrane |
Biomatters, Ltd. | R9 or higher | Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs |
Mega International | – | Technical information at https://mega-international.com/tech-info/ |
Sigma-Aldrich | 65882 | Used for fixating nodule tissues |
VWR Chemicals | 24385.295 | – |
Vink | 219341 | Pouches box material, bottom part |
Leica Biosystems | 14702218311 | Used as a template for plastic embedding |
Merck | 100317 | HCl |
Sigma-Aldrich | I5386-1G | IBA |
Merck | 103862 | C6H5FeO7 |
Merck | 103965 | FeSO4O·7H2O |
Duchefa Biochemie | I1401.0005 | IPTG |
Duchefa Biochemie | K0126.0010 | |
Sigma-Aldrich | L2000 | |
Merck | 105886 | MgSO4O·7H2O |
Merck | 105934 | MnCl2·4H2O |
Merck | 102786 | MnSO4O |
Duchefa Biochemie | M1002.1000 | Used for bacterial culture agar-based medium |
Manutan | 92007687 | Pouches material |
Paraxisdienst | 130774 | Elastic sealing foil |
Pull Rhenen | Agra-Perlite No.3 | Used as growing substrate in pots for nodulation assay |
VWR Chemicals | 391-0581 | Used as container for cellophane membranes |
Thermo-Fisher | F130WH | For genotyping transgenic lines |
Addgene | 50337 | Level 0 terminator, 3’UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus) |
Addgene | 48017 | End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor |
Addgene | 48018 | End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor |
Addgene | 48001 | Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation |
Addgene | 48007 | Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation |
Addgene | 50268 | Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5’UTR, Ω (Tobacco Mosaic Virus) |
Addgene | 46966 | Used for designing CRISPR/Cas9 module |
Addgene | 46968 | Used for designing CRISPR/Cas9 module |
Addgene | 50334 | Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette |
Topzeven | – | Used as filters for washing spore suspension |
Sigma-Aldrich | 8.17003 | PEG400 |
Duchefa Biochemie | E1674.0001 | Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings |
Merck | 104871 | KH2PO4 |
Merck | 105033 | KOH |
Merck | 105153 | K2SO4O |
Van Leusden b.v. | – | Used as growing substrate for mychorrhization assay |
Duchefa Biochemie | S0225.0050 | SH-basal salt medium |
Duchefa Biochemie | S0411.0250 | SH-vitamin mixture |
Lehle Seeds | VIS-02 | Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation |
Merck | 137017 | NaCl |
VWR Chemicals | 89230-072 | C6H11NaO7 |
Merck | 106521 | Na2MoO4·2H2O |
Merck | 106574 | Na2HPO4·7H2O |
Merck | 567549 | NaH2PO4·H2O |
Sigma-Aldrich | 239313 | Na2SO4O |
Duchefa Biochemie | S0809.5000 | C12H22O11 |
Thermo-Fisher | B69 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Thermo-Fisher | EL0013 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64708806 | Methyl methacrylate-based resin powder |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64709003 | HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 66022678 | Methyl methacrylate-based resin solution |
Merck | 1159300025 | |
Acros | 189350250 | |
VWR Chemicals | 663684B | Polysorbate 20 |
Stout Perspex | – | pouches box material, lid |
Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
Merck | 108816 | ZnCl2 |
Alfa Aesar | 33399 | ZnSO4O·7H2O |