पैरास्पोनिया एंडरसनी एक तेजी से बढ़ते उष्णकटिबंधीय पेड़ है जो कैनबिस परिवार (कैनाबेसी) से संबंधित है और राइजोबियम के सहयोग से नाइट्रोजन-फिक्सिंग रूट नोड्यूल बना सकता है। यहाँ, हम पी एंडरसनी में रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन Agrobacterium tumefaciensपर आधारित -मध्यस्थ स्थिर परिवर्तन और CRISPR/Cas9 आधारित जीनोम संपादन.
पैरास्पोनिया एंडरसनी एक तेजी से बढ़ते उष्णकटिबंधीय पेड़ है जो कैनबिस परिवार (कैनाबासी) से संबंधित है। 4 अतिरिक्त प्रजातियों के साथ मिलकर, यह राइजोबियम के साथ नाइट्रोजन-फिक्सिंग नोड्यूल सिम्बायोसिस स्थापित करने में सक्षम केवल ज्ञात गैर-लेगम वंश बनाता है। फलियां और पी एंडरसनी के बीच तुलनात्मक अध्ययन आनुवंशिक नेटवर्क अंतर्निहित रूट नोड्यूल गठन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। तुलनात्मक अध्ययन की सुविधा के लिए, हमने हाल ही में पी एंडोर्नेई जीनोम का अनुक्रम किया और एग्रोबैक्टीरियम टयूफेसिएन्स-मध्यस्थ स्थिर परिवर्तन और CRISPR/Cas9-आधारित जीनोम संपादन की स्थापना की। यहाँ, हम परिवर्तन और जीनोम संपादन प्रक्रियाओं के बारे में एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं जो P. andersoniiके लिए विकसित की गई है। इसके अतिरिक्त, हम बीज अंकुरण की प्रक्रियाओं और सहजीवी फीनोटाइप्स की विशेषता का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, स्थिर ट्रांसजेनिक उत्परिवर्ती लाइनों 2-3 महीने की अवधि में उत्पन्न किया जा सकता है. टी0 ट्रांसजेनिक लाइनों के इन विट्रो प्रचार में वनस्पति फेनोटाइपिंग प्रयोगों को ए tumefaciens सह-कृषि के बाद 4 महीने में शुरू करने की अनुमति देता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल केवल मामूली क्षणिक Agrobacterium राइजोजीन्स -आधारित रूट रूपांतरण विधि पी andersoniiके लिए उपलब्ध से अधिक समय लगता है, हालांकि कई स्पष्ट लाभ प्रदान करता है. साथ में, यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं पी andersonii सहजीवी संघों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस उष्णकटिबंधीय पेड़ के जीव विज्ञान के संभावित अन्य पहलुओं को समझने के उद्देश्य से अध्ययन के लिए एक अनुसंधान मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति.
पैरास्पोनिया एंडरसनी कैनबिस परिवार (कैनाबासी) से संबंधित एक उष्णकटिबंधीय वृक्ष है और पापुआ न्यू गिनी और कई प्रशांत द्वीप समूह1,2,3के मूल निवासी है . 4 अतिरिक्त पैरास्पोनिया प्रजातियों के साथ, यह केवल गैर-लेगम वंश का प्रतिनिधित्व करता है जो राइजोबिया के साथ नाइट्रोजन-फिक्सिंग नोड्यूल सिम्बायोसिस स्थापित कर सकता है। इस सहजीवन का अच्छी तरह से फली (फैबेसी) मॉडल मेडिकागो ट्रंकोटला और लोटस जैपोनिकसमें अध्ययन किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप नोड्यूल गठन और कार्य4के आण्विक आनुवंशिक प्रकृति का विस्तृत ज्ञान प्राप्त होता है . इसके अतिरिक्त, यह प्रदर्शित किया गया था कि फलियां में जड़ नोड्यूल सहजीवन बहुत पुराने पर स्थापित किया गया है, और व्यापक arbuscular mycorrhizal सहजीवन5. Phylogenomic तुलना का सुझाव है कि फलियां, Parasponiaके नाइट्रोजन फिक्सिंग नोड्यूल symbioses, साथ ही, तथाकथित actinorhizal संयंत्र प्रजातियों है कि मेजबान diazotrophic Frankia बैक्टीरिया, एक साझा विकासवादी मूल है 6,7,8. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या फली नोड्यूल गठन में शामिल होने के लिए पहचाने गए जीन संरक्षित आनुवंशिक आधार का हिस्सा हैं, गैर-लेगम प्रजातियों पर अध्ययन आवश्यक हैं। यह अंत करने के लिए, हम एक तुलनात्मक अनुसंधान मॉडल के रूप में पी andersonii का उपयोग करने का प्रस्ताव, फलियां के साथ, मूल आनुवंशिक नेटवर्क अंतर्निहित रूट नोड्यूल गठन और कामकाज की पहचान करने के लिए.
पी andersonii एक अग्रणी है कि ज्वालामुखी पहाड़ियों की ढलानों पर पाया जा सकता है. यह प्रति माह 45 सेमी की वृद्धि की गति को पूरा कर सकता है और 10 मीटर9तक की लंबाई तक पहुंच सकता है . पी एंड्रूनाई के पेड़ हवा-परागण होते हैं, जो अलग-अलग नर और मादा फूलों के गठन से सुविधाजनकहोते हैं 3,10. हमने हाल ही में पी एंडरसनीके द्विगुणित जीनोम (2n ] 20; 560 Mb/1C) का अनुक्रम और एनोटेट किया है, और 2 अतिरिक्त पैरास्पोनिया प्रजातियों के प्रारूप जीनोम अनुक्रमों को इकट्ठा किया है; पी. इससे पता चला कि 35,000 पी एंडरसनी जीन मॉडल जो एम ट्रंकटुला, सोयाबीन (ग्लिसिन मैक्स), अरबीडोप्सिस थालियाना, वुडलैंड स्ट्रॉबेरी ( फ्रेगेरिया वेस्का, ट्रेमा ओरिएन्टेलिस , ब्लैक कॉटन पॉपलर (पॉपुलस ट्राइकोकार्पा) और यूकेलिप्टस (यूकेलिप्टस ग्रैन्डिस)6. इसके अतिरिक्त, M. truncatula और P. andersonii के बीच ट्रांसक्रिप्टोम तुलना 290 putative orthologues का एक सेट है कि दोनों प्रजातियों में एक नोड्यूल बढ़ाया अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित की पहचान6. यह तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन प्रदान करता है.
पी एंडोर्नाली जड़ों और नोड्यूल में जीन प्रकार्य का अध्ययन करने के लिए एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेनेस-मध्यस्थ मूल परिवर्तन के लिए एक प्रोटोकॉलस्थापितकिया गया है . इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, ट्रांसजेनिक जड़ों असर यौगिक पौधों एक अपेक्षाकृत कम समय सीमा में उत्पन्न किया जा सकता है. इस विधि को फली-सहजीवन अनुसंधान12,13,14में भी व्यापक रूप से लागू किया जाता है। हालांकि, इस विधि का नुकसान यह है कि केवल जड़ों बदल रहे हैं और प्रत्येक transgenic जड़ एक स्वतंत्र परिवर्तन घटना का प्रतिनिधित्व करता है, पर्याप्त भिन्नता में जिसके परिणामस्वरूप. इसके अलावा, परिवर्तन क्षणिक है और ट्रांसजेनिक लाइनों बनाए रखा नहीं जा सकता है. यह ए राइजोजीन्स-आधारित रूट ट्रांसफॉर्मेशन को CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीनोम संपादन के लिए कम अनुकूल बनाता है। इसके अतिरिक्त, ए राइजोजेने अपने रूट इनोवेन्चिंग टिड्डी (रोल ) जीनों को पौधे के जीनोम में स्थानांतरित कर देते हैं, जो एक बार हार्मोन होमोस्टेसिस15के साथ हस्तक्षेप व्यक्त करते थे। यह ए राइजोजेनेसमें पौधे हार्मोन की भूमिका का अध्ययन करना – रूपांतरित जड़ों को चुनौतीपूर्ण बनाता है। इन सीमाओं को पार करने के लिए, हमने हाल ही में एग्रोबैक्टीरियम tumefaciens-आधारितपरिवर्तन और CRISPR/Cas9-मध्यस्थमटजनन के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है।
यहाँ, हम ए tumefaciensआधारित परिवर्तन प्रक्रिया का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं और रिवर्स आनुवंशिकी पाइप लाइन पी andersoniiके लिए विकसित की है. इसके अतिरिक्त, हम ट्रांसजेनिक plantlets के बहाव से निपटने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, symbiotic बातचीत का अध्ययन करने के लिए assays सहित. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एक 2-3 महीने की अवधि में एकाधिक ट्रांसजेनिक लाइनें उत्पन्न की जा सकती हैं। CRISPR/Cas9-मध्यस्थ उत्तजनन के साथ संयोजन में, यह नॉकआउट उत्परिवर्ती लाइनों के कुशल पीढ़ी की अनुमति देता है. इन उत्परिवर्ती रेखाओं को इन विट्रो10,16,17में वनस्पति रूप से प्रचारित किया जा सकता है , जो परिवर्तन प्रक्रिया के 4 महीनों में फेनोटाइपिक लक्षणीकरण शुरू करने के लिए पर्याप्त सामग्री उत्पन्न करने की अनुमति देता है 10शुरू किया गया है . साथ में, प्रक्रियाओं के इस सेट किसी भी प्रयोगशाला के अध्ययन के लिए एक अनुसंधान मॉडल के रूप में पी andersonii अपनाने के लिए rhizobial और mycorrhizal संघों, साथ ही संभावित रूप से इस उष्णकटिबंधीय पेड़ के जीव विज्ञान के अन्य पहलुओं को समझने के उद्देश्य से अनुमति देनी चाहिए.
फलियां और दूर से संबंधित कैनाबसी जीनस पैरास्पोनिया पौधों की प्रजातियों के केवल दो क्लैडों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो नाइट्रोजन-फिक्सिंग राइजोबिया के साथ एंडोसिबायोटिक संबंध स्थापित करने और रूट नोड्यूल बनाते हैं। दोनों clades की प्रजातियों के बीच तुलनात्मक अध्ययन अत्यधिक इस सहजीवन की अनुमति कोर आनुवंशिक नेटवर्क में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए प्रासंगिक हैं. वर्तमान में, आनुवंशिक अध्ययन मुख्य रूप से फलियां में किया जाता है; विशेष रूप से दो मॉडल प्रजातियों एम truncatula और एल Japonicus. एक अतिरिक्त प्रयोगात्मक मंच प्रदान करने और एक nodulating गैर-लेगम के साथ तुलनात्मक अध्ययन की सुविधा के लिए, हम यहाँ स्थिर परिवर्तन और पी andersoniiमें आनुवंशिक विश्लेषण रिवर्स के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रस्तुत प्रोटोकॉल टी0 ट्रांसजेनिक पी एंडरसनी लाइनों के विट्रो प्रचार में उपयोग करता है, phenotypic विश्लेषण ए tumefaciens सह खेती के बाद 4 महीने के भीतर शुरू करने की अनुमति. फलियां33के स्थिर परिवर्तन के लिए स्थापित किए गए वर्तमान प्रोटोकॉलों की तुलना में यह काफी तेज है . यह पी andersonii एक आकर्षक अनुसंधान मॉडल बनाता है.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं. जिनमें से पहला बीज अंकुरण से संबंधित है। अंकुरण के लिए पी एंडरसनी बीज तैयार करने के लिए, बीज जामुन से अलग करने की आवश्यकता है। यह ऊतक कागज के एक टुकड़े पर या एक चाय छलनी के अंदर के खिलाफ जामुन रगड़ द्वारा किया जाता है. बीज कोट को नुकसान को रोकने के लिए इस प्रक्रिया को धीरे से किया जाना चाहिए। यदि बीज कोट क्षतिग्रस्त हो जाता है, ब्लीच नसबंदी के दौरान बीज में प्रवेश कर सकता है, जो बीज व्यवहार्यता कम कर देता है. बीज निद्रा को तोड़ने के लिए, बीज एक 10 दिन के तापमान चक्र के अधीन हैं। हालांकि, इस उपचार के बावजूद, अंकुरण पूरी तरह से सिंक्रनाइज़ नहीं है। आम तौर पर, पहले बीज 7 दिनों के बाद मूलांक उद्भव दिखाते हैं, लेकिन दूसरों को अंकुरित होने में कई दिन लग सकते हैं।
परिवर्तन प्रक्रिया में महत्वपूर्ण बिंदु प्रारंभिक सामग्री के चुनाव और सह-कृषि चरण की अवधि से संबंधित हैं। कुशल परिवर्तन तक पहुँचने के लिए, यह सबसे अच्छा है स्वस्थ और युवा उपजी या प्रारंभिक सामग्री के रूप में गैर बाँझ ग्रीनहाउस विकसित पौधों के डंठल का उपयोग करें. युवा शाखाओं के विकास को प्रेरित करने के लिए, हर 2-3 महीने में परपोनिया के पेड़ को ट्रिम करने और साल में एक बार पेड़ों को ताज़ा करने की सलाह दी जाती है। इसके अतिरिक्त, सह-कृषि चरण केवल 2 दिनों के लिए किया जाना चाहिए। लंबे समय तक सह-कृषि ए tumefaciens द्वारा ऊतक explants के अधिक उपनिवेशन को बढ़ावा देता है और आम तौर पर परिवर्तन दक्षता कम कर देता है। ए tumefaciens द्वारा अति उपनिवेशन को रोकने के लिए यह भी नियमित रूप से प्लेटें जिस पर explants खेती कर रहे हैं ताज़ा करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि अधिक उपनिवेशन होता है, तो ऊतक एक्सप्लांट्स को धोया जा सकता है (धारा 3.8 देखें) ए tumefaciens कोशिकाओं को दूर करने के लिए। हम धोने के लिए इस्तेमाल किया एसएच-10 समाधान करने के लिए ब्लीच जोड़ने की सलाह (अंतिम एकाग्रता: $2% hypochlorite). यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह अतिरिक्त वाशिंग चरण भारी संक्रमित एक्सप्लांट्स पर काम नहीं कर सकता है (चित्र 2ख)। यदि CRISPR/Cas9 के साथ एक रूपांतरण पैदावार केवल putatively रूपांतरित शूटिंग की एक सीमित संख्या में या यदि एक विशेष जीन के mutagenesis पुनर्जनन में समस्याओं के कारण की उम्मीद है, यह एक खाली वेक्टर नियंत्रण निर्माण के रूप में शामिल करने के लिए सलाह दी जाती है सकारात्मक नियंत्रण. अंत में, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि चयनित सभी ट्रांसजेनिक लाइनों स्वतंत्र टी-डीएनए एकीकरण घटनाओं से उत्पन्न होते हैं। इसलिए, हम एक एक्सप्लांट के प्रत्येक पक्ष से केवल एक putatively-ट्रांसजेनिक गोली लेने के लिए निर्देश. हालांकि, हम महसूस करते हैं कि यह स्वतंत्र लाइनों की संभावित संख्या कम कर देता है। यदि कई लाइनों की आवश्यकता होती है, तो शोधकर्ताओं ने putatively-transformed calli को मूल एक्सप्लांटसे अलग करने का निर्णय ले सकता है जब ये कैली आकार और संस्कृति में 2 मिमी हैं, तो ये कैली स्वतंत्र रूप से। इस तरह, कई लाइनों प्रत्येक explant, जो संभावित transgenic लाइनों की संख्या को जन्म देती से अलग किया जा सकता है.
वर्तमान प्रोटोकॉल में, पी एंडरसनी की ट्रांसजेनिक लाइनों का इनविट्रो प्रचार के माध्यम से वनस्पति रूप से प्रचारित किया जाता है। इस का लाभ यह है कि कई ट्रांसजेनिक plantlets एक अपेक्षाकृत कम समय अवधि में उत्पन्न किया जा सकता है. हालांकि, इस विधि भी कई सीमाएँ हैं। सबसे पहले, इन विट्रो प्रचार के माध्यम से टी0 ट्रांसजेनिक लाइनों का रखरखाव श्रम गहन है और इसके परिणामस्वरूप अवांछित आनुवंशिक या एपिजेनेटिक परिवर्तन34,35हो सकते हैं. दूसरे, टी0 लाइनों अभी भी टी डीएनए की एक प्रति होते हैं, एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट सहित. यह संभव पुन: परिवर्तन की संख्या को सीमित करता है, के रूप में विभिन्न चयन मार्कर प्रत्येक पुन: परिवर्तन के लिए आवश्यक हैं. वर्तमान में, हम केवल kanamycin या hygromycin चयन (डेटा नहीं दिखाया) का उपयोग कर परिवर्तन का परीक्षण किया है. इसके अलावा, T0 ट्रांसजेनिक लाइनों में Cas9-एन्कोडिंग अनुक्रम और sgRNAs की उपस्थिति पूरक अध्ययन जटिल. पूरक परख संभव है, लेकिन sgRNA लक्ष्य साइट (ओं) की आवश्यकता के लिए इस तरह के रूप में उत्परिवर्तित किया जा सकता है कि पूरक निर्माण के जीन संपादन रोका है. तीसरे, टी0 लाइनों के साथ काम करने का एक नुकसान यह है कि CRISPR/Cas9 उत्परिवर्ती झंकार हो सकता है. झंकार उत्परिवर्ती लाइनों के phenotypic विश्लेषण को रोकने के लिए, हम कम से कम 3 अलग अलग शूटिंग पर इन विट्रो प्रचार के बाद जीनोटाइपिंग विश्लेषण दोहराने की सलाह देते हैं। हालांकि, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त झंकार उत्परिवर्ती की संख्या सीमित है, वे कभी कभी मनाया जाता है10. टी0 लाइनों के साथ काम करने की सीमाओं को दूर करने के लिए, पी andersonii उत्परिवर्ती लाइनों पैदा करने से प्रचारित किया जा सकता है. पी andersonii पेड़ dioecious और हवा परागण2कर रहे हैं. इसका मतलब यह है कि प्रत्येक ट्रांसजेनिक लाइन के रूप में हेरफेर किया जाना चाहिए कि पुरुष और महिला फूल एक ही व्यक्ति पर उत्पादित कर रहे हैं, और बाद में इस तरह के रूप में हो कि पार परागण नहीं होता है. के रूप में पी andersonii एक तेजी से बढ़ पेड़ यह एक उष्णकटिबंधीय ग्रीनहाउस में अंतरिक्ष की एक पर्याप्त राशि की आवश्यकता है (28 डिग्री सेल्सियस, $ 85% सापेक्ष आर्द्रता). इसलिए, यद्यपि तकनीकी रूप से संभव है, पी एंडरसनी ट्रांसजेनिक लाइनों का उत्पादक प्रचार logically चुनौतीपूर्ण है.
प्रोटोकॉल अनुभाग में, हमने P. andersoniiकी मंजूरी के लिए 3 विधियों का वर्णन किया है। प्लेट और पाउच सिस्टम का लाभ यह है कि जड़ें आसानी से सुलभ हैं, जो बैक्टीरिया के स्पॉट-इनोकेशन की अनुमति दे सकती है और समय के साथ नोड्यूल गठन के बाद हो सकती है। हालांकि, प्लेट प्रणाली काफी श्रम गहन है, जो इसे कम बड़े पैमाने पर नोडुलेशन प्रयोगों के लिए अनुकूल बनाता है। थैली प्रणाली का एक नुकसान यह है कि कवक संदूषण को रोकने के लिए मुश्किल है. पाउच बाँझ नहीं हैं, और इसलिए कवक विकास अक्सर थैली के शीर्ष आधे पर मनाया जाता है। हालांकि, यह पी एंडरसनी विकास को प्रभावित नहीं करता है, और इसलिए मंजूरी परख के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। इसके अतिरिक्त, थैली प्रणाली पौध के लिए ही उपयुक्त है. कई प्रयासों के बावजूद, हम पाउच में इन विट्रो प्रचार के माध्यम से प्राप्त पौधों को विकसित करने में असमर्थ रहे हैं।
यहाँ वर्णित पी एंडरसनी रिवर्स जेनेटिक्स पाइपलाइन मौजूदा ए राइजोजेनेसआधारित रूट ट्रांसफॉर्मेशन विधि11की तुलना में पर्याप्त सुधार प्रदान करता है . वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग करना, स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों कुशलता से उत्पन्न किया जा सकता है और इन विट्रो प्रचार के माध्यम से बनाए रखा जा सकता है. इसके विपरीत, ए राइजोजेन रूपांतरण क्षणिक होता है और केवल ट्रांसजेनिक जड़ों के गठन में परिणाम होता है। क्योंकि प्रत्येक ट्रांसजेनिक रूट एक स्वतंत्र परिवर्तन से परिणाम, ए राइजोजेन रूपांतरण आधारित परख पर्याप्त phenotypic भिन्नता से ग्रस्त हैं. यह भिन्नता स्थिर रेखाओं के मामले में बहुत कम है, यद्यपि इन विट्रो प्रोपेगेशन में भी कुछ भिन्नता का स्तर पैदा होता है। इस कम भिन्नता और तथ्य यह है कि कई plantlets प्रत्येक स्थिर लाइन के लिए phenotyped किया जा सकता है की वजह से, स्थिर लाइनों ए rhizogenes-transformed जड़ों की तुलना में मात्रात्मक परख के लिए अधिक अनुकूल हैं. इसके अतिरिक्त, स्थिर रूपांतरण ए राइजोजेने सितर्णिक पथ (रोल ) की शुरूआत पर निर्भर नहीं करता है जो अंतर्जात हार्मोन संतुलन15को प्रभावित करता है। इसलिए, स्थिर लाइनें ए राइजोजेनेस-रूपांतरण जड़ों की तुलना में हार्मोन होमियोस्टेसिस में शामिल जीनों के रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण के लिए बेहतर अनुकूल हैं। अनुसंधान मॉडल के रूप में पी andersonii का एक अधिक सामान्य लाभ यह है कि यह एक हाल ही में पूरे जीनोम दोहराव (WGD) का अनुभव नहीं किया. फली Papilionoideae उपपरिवार, जो मॉडल फलियां एम truncatula और एल Japonicus,साथ ही साथ Salicaceae (आदेश Malpighiales) कि मॉडल पेड़ Populus trichocarpa अनुभवी WGDs भी शामिल है शामिल हैं दस लाख साल पहले36,37. इन डब्ल्यूजीडी से उत्पन्न होने वाली कई पैरालॉगस जीन प्रतियां एम ट्रंकटुला, एल जैपोनिकस और पी ट्राइकोकार्पा37,38,39के जीनोम में रखी जाती हैं , जो बनाता है अतिरेक जो रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण ों को जटिल बना सकता है। के रूप में पी andersonii हाल ही में WGD का अनुभव नहीं था, पी andersonii पर रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण कम paralogous जीन प्रतियां के अनावश्यक कामकाज से प्रभावित हो सकता है.
एक साथ लिया, हम पी andersoniiमें रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एकल उत्परिवर्ती लाइनों कुशलतासे 2-3 महीने10की एक समय सीमा में उत्पन्न किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल को विभिन्न जीनों को एक साथ लक्षित करने वाले एसजीआरएन के प्रवर्तकों के माध्यम से उच्च क्रम म्यूटेंट बनाने के लिए बढ़ाया जा सकता है, जैसा कि अन्य पौधों की प्रजातियों40,41,42के लिए दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, यहाँ वर्णित स्थिर रूपांतरण प्रक्रिया CRISPR/Cas9 जीन-लक्ष्यीकरण तक सीमित नहीं है, लेकिन अन्य प्रकार के निर्माणों को लागू करने के लिए भी उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, प्रमोटर-रिपोर्टर परख के लिए, अस्थानिक अभिव्यक्ति या ट्रांस– पूरक) हमने पी एंड्र्सेनरी को नाइट्रोजन-फिक्सिंग राइजोबिया या एंडोमाइकोरल कवक के साथ पारस्परिक सहजीवन का अध्ययन करने के लिए एक तुलनात्मक अनुसंधान मॉडल के रूप में स्थापित किया। हालांकि, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल भी इस उष्णकटिबंधीय पेड़ के जीव विज्ञान के अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपकरण प्रदान करते हैं, जैसे लकड़ी के गठन, द्वि-लैंगिक फूलों का विकास या कैनाबी-विशिष्ट माध्यमिक चयापचयों के biosynthesis.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को स्वीकार करने के लिए मार्क Youles, सोफीन Kamoun और Sylvestre Marillonnet गोल्डन गेट क्लोनिंग भागों Addgene डेटाबेस के माध्यम से उपलब्ध बनाने के लिए पसंद है. इसके अतिरिक्त, हम ई जेम्स, पी Hadobas, और पी एंडरसनी बीज के लिए टी जे Higgens शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम को नीदरलैंड ऑर्गेनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (NWO-VICI अनुदान 865.13.001) द्वारा समर्थित किया गया था; NWO-ओपन प्रतियोगिता अनुदान 819.01.007) और इंडोनेशिया गणराज्य के अनुसंधान, प्रौद्योगिकी और उच्च शिक्षा मंत्रालय (RISET-प्रो अनुदान 8245 आईडी).
Sigma-Aldrich | N0640 | NAA |
Duchefa Biochemie | M1503.0250 | MES |
Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
Duchefa Biochemie | X1402.1000 | X-Gal |
Merck | 101236 | For nucleic acid electrophoresis gel |
– | – | Pouches box material, hangers |
Merck | 101188 | NH4NO3 |
Sigma-Aldrich | B3408-1G | BAP |
Merck | 100156 | H3BO3 |
Thermo-Fisher | ER1011 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly |
Thermo-Fisher | 15561020 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Merck | 137101 | CaCl2·2H2O |
Duchefa Biochemie | C0111.0025 | C16H16N5O7S2Na |
Thermo-Fisher | K1231 | Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure |
Agronutrition | AP2011 | Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay |
Merck | 102790 | CuSO4·5H2O |
Duchefa Biochemie | D1004.1000 | Used for plant tissue culture agar-based medium |
Merck | 105101 | K2HPO4 |
VWR Chemicals | 20302.293 | Na2·EDTA |
Duchefa Biochemie | M0803.1000 | C6H14O6 |
Thermo-Fisher | ER0291 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly |
Merck | 100983 | C2H5OH |
VWR Chemicals | BDH9232-500G | EDTA |
Sigma-Aldrich | Z377600-1PAK | Cellophane membrane |
Biomatters, Ltd. | R9 or higher | Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs |
Mega International | – | Technical information at https://mega-international.com/tech-info/ |
Sigma-Aldrich | 65882 | Used for fixating nodule tissues |
VWR Chemicals | 24385.295 | – |
Vink | 219341 | Pouches box material, bottom part |
Leica Biosystems | 14702218311 | Used as a template for plastic embedding |
Merck | 100317 | HCl |
Sigma-Aldrich | I5386-1G | IBA |
Merck | 103862 | C6H5FeO7 |
Merck | 103965 | FeSO4O·7H2O |
Duchefa Biochemie | I1401.0005 | IPTG |
Duchefa Biochemie | K0126.0010 | |
Sigma-Aldrich | L2000 | |
Merck | 105886 | MgSO4O·7H2O |
Merck | 105934 | MnCl2·4H2O |
Merck | 102786 | MnSO4O |
Duchefa Biochemie | M1002.1000 | Used for bacterial culture agar-based medium |
Manutan | 92007687 | Pouches material |
Paraxisdienst | 130774 | Elastic sealing foil |
Pull Rhenen | Agra-Perlite No.3 | Used as growing substrate in pots for nodulation assay |
VWR Chemicals | 391-0581 | Used as container for cellophane membranes |
Thermo-Fisher | F130WH | For genotyping transgenic lines |
Addgene | 50337 | Level 0 terminator, 3’UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus) |
Addgene | 48017 | End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor |
Addgene | 48018 | End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor |
Addgene | 48001 | Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation |
Addgene | 48007 | Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation |
Addgene | 50268 | Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5’UTR, Ω (Tobacco Mosaic Virus) |
Addgene | 46966 | Used for designing CRISPR/Cas9 module |
Addgene | 46968 | Used for designing CRISPR/Cas9 module |
Addgene | 50334 | Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette |
Topzeven | – | Used as filters for washing spore suspension |
Sigma-Aldrich | 8.17003 | PEG400 |
Duchefa Biochemie | E1674.0001 | Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings |
Merck | 104871 | KH2PO4 |
Merck | 105033 | KOH |
Merck | 105153 | K2SO4O |
Van Leusden b.v. | – | Used as growing substrate for mychorrhization assay |
Duchefa Biochemie | S0225.0050 | SH-basal salt medium |
Duchefa Biochemie | S0411.0250 | SH-vitamin mixture |
Lehle Seeds | VIS-02 | Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation |
Merck | 137017 | NaCl |
VWR Chemicals | 89230-072 | C6H11NaO7 |
Merck | 106521 | Na2MoO4·2H2O |
Merck | 106574 | Na2HPO4·7H2O |
Merck | 567549 | NaH2PO4·H2O |
Sigma-Aldrich | 239313 | Na2SO4O |
Duchefa Biochemie | S0809.5000 | C12H22O11 |
Thermo-Fisher | B69 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Thermo-Fisher | EL0013 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64708806 | Methyl methacrylate-based resin powder |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64709003 | HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 66022678 | Methyl methacrylate-based resin solution |
Merck | 1159300025 | |
Acros | 189350250 | |
VWR Chemicals | 663684B | Polysorbate 20 |
Stout Perspex | – | pouches box material, lid |
Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
Merck | 108816 | ZnCl2 |
Alfa Aesar | 33399 | ZnSO4O·7H2O |