Parasponia andersonii er et raskt voksende tropisk tre som tilhører cannabis-familien (Cannabaceae) og kan danne nitrogen-fixing rot knuter i forbindelse med Rhizobium. Her beskriver vi en detaljert protokoll for omvendt genetiske analyser i P. andersonii basert på Agrobacterium tumefaciens-MEDIERT stabil transformasjon og CRISPR/Cas9-baserte Genova redigering.
Parasponia andersonii er et raskt voksende tropisk tre som tilhører cannabis-familien (Cannabaceae). Sammen med 4 andre arter, danner det den eneste kjente ikke-legume avstamning i stand til å etablere en nitrogen-fixing nodule symbiose med Rhizobium. Sammenlignende studier mellom belgfrukter og P. andersonii kan gi verdifull innsikt i de genetiske nettverkene underliggende root nodule formasjon. For å lette sammenlignende studier, vi nylig sekvensert P. andersonii Genova og etablerte Agrobacterium tumefaciens-MEDIERT stabil transformasjon og CRISPR/Cas9-baserte Genova redigering. Her gir vi en detaljert beskrivelse av transformasjon og Genova redigerings prosedyrer utviklet for P. andersonii. I tillegg beskriver vi prosedyrer for frøet spire og karakterisering av symbiotisk fenotyper. Ved hjelp av denne protokollen kan stabile transgene mutant linjer genereres i en periode på 2-3 måneder. Vegetative in vitro-spredning av T0 transgene Lines gjør det mulig for bestemmelse av fenotype eksperimenter å initieres ved 4 måneder etter A. tumefaciens co-dyrking. Denne protokollen tar derfor bare marginalt lenger enn den midlertidige Agrobacterium rhizogenesrot transformerings metoden som er tilgjengelig for P. andersonii, men tilbyr flere klare fordeler. Sammen prosedyrene beskrevet her tillater P. andersonii skal brukes som en forsknings modell for studier som tar sikte på å forstå symbiotisk foreninger så vel som potensielt andre aspekter av biologi av denne tropiske treet.
Parasponia andersonii er et tropisk tre som tilhører cannabis familien (Cannabaceae) og er innfødt til Papua Ny Guinea og flere Stillehavsøyene1,2,3. Sammen med 4 ekstra Parasponia arter, representerer den den eneste ikke-legume avstamning som kan etablere en nitrogen-fixing nodule symbiose med rhizobia. Dette symbiose er godt studert i legume (Fabaceae) modeller Medicago truncatula og Lotus japonicus, som har resultert i å anskaffe detaljert kunnskap om den molekylære genetiske natur nodule formasjon og funksjon4. I tillegg ble det demonstrert at roten nodule symbiose i belgfrukter er grunnlagt på den mye eldre, og utbredt arbuscular mycorrhizal symbiose5. Phylogenomic sammenligninger tyder på at nitrogen-fixing nodule symbioses av belgfrukter, Parasponia, så vel som, den såkalte actinorhizal plantearter som er vert diazotrophic Frankia bakterier, har en felles evolusjonær opprinnelse 6,7,8. For å avgjøre om genene identifisert å være involvert i legume nodule formasjon er den delen av en bevart genetisk basis, studier på ikke-legume arter er avgjørende. For dette formål, foreslår vi å bruke P. andersonii som en komparativ forsknings modell, sammen med belgfrukter, for å identifisere kjernen genetiske nettverk underliggende root nodule formasjon og funksjon.
P. andersonii er en pioner som kan bli funnet i bakkene av vulkanske åser. Det kan møte vekst hastigheter på 45 cm per måned og nå lengder på opptil 10 meter9. P. andersonii trær er vind-pollinated, som er tilrettelagt ved dannelsen av separate mannlige og kvinnelige blomster3,10. Vi har nylig sekvensert og kommenterte diploid Genova (2n = 20; 560 MB/1C) av P. andersonii, og samlet utkast til Genova sekvenser av 2 ekstra Parasponia arter; P. Rigida og p. rugosa6. Dette avslørte ~ 35 000 P. andersonii gen modeller som kan grupperes i > 20000 orthogroups sammen med gener fra M. truncatula, soyabønner (Glycine Max), Arabidopsis thaliana, skog jordbær ( Fragaria jordbær), trema orientalis, svart bomull poppel (Populus trichocarpa) og eucalypt (eucalyptus grandis)6. I tillegg transcriptome sammenligninger mellom M. truncatula og P. andersonii identifiserte et sett med 290 antatte orthologues som viser et nodule-forbedret uttrykks mønster i begge artene6. Dette gir en utmerket ressurs for sammenlignende studier.
For å studere gen funksjonen i P. andersonii røtter og knuter, har det blitt etablert en protokoll for Agrobacterium rhizogenes-mediert rot transformasjon11. Ved hjelp av denne protokollen, sammensatte planter bærende transgene røtter kan genereres i en relativt kort tidsramme. Denne metoden er også mye brukt i legume-symbiose forskning12,13,14. Men ulempen med denne metoden er at bare røttene er forvandlet og at hver transgene root representerer en uavhengig transformasjon hendelse, noe som resulterer i betydelig variasjon. Transformasjonen er også forbigående og transgene Lines kan ikke opprettholdes. Dette gjør en. rhizogenes-basert root transformasjon mindre egnet for CRISPR/Cas9-mediert Genova redigering. I tillegg, A. rhizogenes overfører sine root inducing geometrisk knute punkt (ROL) gener til anlegget Genova, som en gang uttrykt forstyrre hormon homeostase15. Dette gjør studere rollen av plantehormoner i A. rhizogenes-forvandlet røtter utfordrende. For å overkomme disse begrensningene har vi nylig utviklet en protokoll for Agrobacterium tumefaciens-basert transformasjon og CRISPR/Cas9-mediert mutagenese av P. andersonii10.
Her gir vi en detaljert beskrivelse av a. tumefaciens-basert transformasjon prosedyre og omvendt genetikk rørledning utviklet for P. andersonii. I tillegg gir vi protokoller for nedstrøms håndtering av transgene plantlets, inkludert analyser for å studere symbiotisk interaksjoner. Ved å bruke protokollen som er beskrevet her, kan flere transgene-linjer genereres i løpet av en 2-3 måneders periode. I kombinasjon med CRISPR/Cas9-mediert mutagenese, dette tillater effektiv generering av knockout mutant linjer. Disse muterte linjene kan vegetativt spres i vitro10,16,17, som tillater tilstrekkelig materiale skal genereres for å starte fenotypiske karakterisering på 4 måneder etter at transformasjonen prosedyren har blitt igangsatt10. Sammen, dette settet med prosedyrer bør tillate enhver Lab å vedta P. andersonii som en forsknings modell for studier som tar sikte på å forstå rhizobial og mycorrhizal foreninger, samt potensielt andre aspekter av biologi av dette tropiske treet.
Belgfrukter og den fjernt-relaterte Cannabaceae slekten Parasponia representerer de eneste to klader av plantearter i stand til å etablere et endosymbiotic forhold til nitrogen-fixing rhizobia og danner rot knuter. Sammenlignende studier mellom arter av begge klader er svært relevante for å gi innsikt i de viktigste genetiske nettverkene som tillater dette symbiose. For tiden er genetiske studier i hovedsak gjort i belgfrukter; spesielt de to modell artene M. truncatula og L. japonicus. For å gi en ekstra eksperimentell plattform og tilrettelegge komparative studier med en nodulating ikke-legume, beskriver vi her en detaljert protokoll for stabil transformasjon og omvendt genetiske analyser i P. andersonii. Den presenterte protokollen bruker in vitro forplantning av T0 transgene P. andersonii linjer, slik at fenotypiske analyse skal igangsettes innen 4 måneder etter A. tumefaciens co-dyrking. Dette er vesentlig raskere enn dagens protokoller som er etablert for stabil transformasjon av belgfrukter33. Dette gjør P. andersonii en attraktiv forsknings modell.
Protokollen som beskrives her, inneholder flere viktige trinn. Det første som angår frø spire. For å forberede P. andersonii frø for spire, frø må isoleres fra bær. Dette gjøres ved å gni bærene på et stykke silkepapir eller mot innsiden av en te sil. Denne prosedyren må utføres forsiktig for å hindre skade på frø pelsen. Hvis frøet pelsen blir skadet, blekemiddel kunne gå inn i frøet under sterilisering, noe som reduserer frø levedyktighet. Å bryte frø dormancy, frø er utsatt for en 10-dagers temperatur syklus. Men til tross for denne behandlingen, er spire ikke helt synkronisert. Vanligvis, de første frøene viser radicle fremveksten etter 7 dager, men andre kan ta flere dager lengre tid å spire.
Kritiske punkter i transformasjon prosedyren gjelder valg av Start materialet og varigheten av co-dyrking trinn. For å nå effektiv transformasjon, er det best å bruke sunne og unge stengler eller petioles av ikke-sterile drivhus dyrket planter som utgangsmaterialet. For å indusere veksten av unge grener, er det tilrådelig å trimme Parasponia trær hver 2-3 måneder og friske trær en gang i året. I tillegg må co-dyrking trinn skal utføres for 2 dager bare. Langvarig co-dyrking fremmer over-kolonisering av vev explants av A. tumefaciens og generelt reduserer transformasjon effektivitet. For å hindre over-kolonisering av A. tumefaciens det er også viktig å regelmessig oppdatere platene som explants er dyrket. I tilfelle over-kolonisering forekommer, kan vevs explants vaskes (se Seksjon 3,8) for å fjerne A. tumefaciens celler. Vi anbefaler å legge blekemiddel til SH-10 løsning som brukes til vask (endelig konsentrasjon: ~ 2% natriumhypokloritt). Det er viktig å merke seg at dette ekstra vaske trinnet kanskje ikke fungerer på tungt infiserte explants (figur 2b). I tilfelle en transformasjon med en CRISPR/Cas9 konstruere gir bare et begrenset antall påstått-transformert skudd eller hvis mutagenese av et bestemt gen er forventet å forårsake problemer i regenerering, er det tilrådelig å inkludere en tom vektor kontroll konstruere som den positive kontrollen. Til slutt er det viktig å sikre at alle transgene-linjer som velges er et resultat av uavhengige hendelser i T-DNA-integrasjon. Derfor instruerer vi til å ta bare ett påstått-transgene Shoot fra hver side av en explant. Vi innser imidlertid at dette reduserer det potensielle antallet uavhengige linjer. Hvis mange linjer er nødvendig, kan forskerne bestemme seg for å skille påstått-forvandlet calli fra den opprinnelige explants når disse calli er ≥ 2 mm i størrelse og kultur disse calli uavhengig. På denne måten kan flere linjer isoleres fra hver explant, noe som øker antall potensielle transgene linjer.
I den gjeldende protokollen, transgene linjer av P. andersonii spres vegetativt gjennom in vitro forplantning. Fordelen med dette er at mange transgene plantlets kan genereres på relativt kort tidsperiode. Imidlertid har denne metoden også flere begrensninger. For det første er vedlikeholdet av T0 transgene Lines gjennom in vitro forplantning arbeidsintensiv og kan føre til uønskede genetiske eller epigenetic endringer34,35. For det andre, T0 linjer fortsatt inneholde en kopi av t-DNA, inkludert antibiotikaresistens kassetten. Dette begrenser antall mulige re-transformasjoner, som ulike utvalgs markører er nødvendig for hver re-transformasjon. Foreløpig har vi bare testet transformasjon ved hjelp av kanamycin eller hygromycin utvalg (data ikke vist). Videre, tilstedeværelsen av Cas9-koding sekvens og sgRNAs i T0 transgene linjene kompliserer komplementering studier. Komplementering analyser er mulig, men krever sgRNA målområdet (e) for å være mutert som sådan at gen-redigering av komplementering konstruere er forhindret. For det tredje, en ulempe med å arbeide med T0 linjer er at CRISPR/Cas9 mutanter kan være chimeric. For å forhindre fenotypiske analyse av chimeric mutant linjer anbefaler vi at du gjentar genotyperingteknologi analysen etter in vitro-forplantning på minst 3 forskjellige skudd. Selv om antall chimeric mutanter innhentet ved hjelp av protokollen som er beskrevet her er begrenset, de er tidvis observert10. For å overvinne begrensningene ved å arbeide med T0 linjer, kan P. andersonii mutant linjer overføres generatively. P. andersonii trær er dioecious og vind-pollinated2. Dette betyr at hver transgene linje må manipuleres som sådan at mannlige og kvinnelige blomster er produsert på en enkelt person, og senere vokst som sådan at korset pollinering ikke oppstår. Som P. andersonii er en raskt voksende treet det krever en betydelig mengde plass i et tropisk drivhus (28 ° c, ~ 85% relativ fuktighet). Derfor, selv om det er teknisk mulig, er generative forplantning av P. andersonii transgene Lines logistisk utfordrende.
I protokoll seksjonen har vi beskrevet 3 metoder for nodulation av P. andersonii. Fordelen med platen og posen systemer er at røttene er lett tilgjengelig, som kan tillate flekk-inoculation av bakterier og etter nodule formasjon over tid. Imidlertid er plate systemet ganske arbeidsintensiv, noe som gjør det mindre egnet for store nodulation eksperimenter. En ulempe med posen systemet er at det er vanskelig å hindre sopp forurensning. Poser er ikke sterile, og derfor soppvekst er ofte observert på den øverste halvdelen av posen. Men dette påvirker ikke P. andersonii vekst, og derfor ikke forstyrrer nodulation analyser. I tillegg er posen systemet kun egnet for frøplanter. Til tross for flere forsøk, har vi ikke vært i stand til å vokse plantlets innhentet gjennom in vitro forplantning i poser.
P. andersonii omvendt genetikk rørledningen beskrevet her gir en betydelig forbedring i forhold til den eksisterende a. rhizogenes-basert root Transformation metode11. Ved hjelp av de beskrevne prosedyrene kan stabile transgene-linjer genereres effektivt og kan opprettholdes via in vitro-forplantning. I kontrast er A. rhizogenes transformasjon forbigående og resulterer bare i dannelsen av transgene røtter. Fordi hver transgene root resultater fra en uavhengig transformasjon, A. rhizogenes transformasjon-baserte analyser lider av betydelig fenotypiske variasjon. Denne variasjonen er mye mindre i tilfelle av stabile linjer, selv om in vitro forplantning også skaper noen grad av variasjon. På grunn av denne reduserte variasjonen og det faktum at flere plantlets kunne phenotyped for hver stabil linje, er stabile linjer mer egnet for kvantitative analyser sammenlignet med en. rhizogenes-forvandlet røtter. I tillegg er den stabile transformasjonen ikke avhengig av innføringen av A. rhizogenes root inducing geometriske (ROL) som påvirker den endogene hormonet balanse15. Derfor stabile linjer er bedre egnet for omvendt genetisk analyse av gener involvert i hormon homeostase sammenlignet med A. rhizogenes-forvandlet røtter. En mer generell fordel av P. andersonii som forsker modell er at det ikke opplever en nylig hele Genova DUPLISERING (WGD). Den legume Papilionoideae gruppe, som inkluderer modellen belgfrukter M. truncatula og L. Japonicus, samt Vierfamilien (rekkefølge Malpighiales) som inkluderer modelltreet Populus trichocarpa erfarne WGDs ~ 65 millioner år siden36,37. Mange paralogous Gene eksemplarer som følge av disse WGDs er beholdt i genomer av M. truncatula, L. japonicus og P. trichocarpa37,38,39, som skaper redundans som kan komplisere omvendt genetiske analyser. Ettersom p. andersonii ikke opplevde en nylig WGD, kan omvendt genetiske analyser på P. andersonii bli mindre påvirket av overflødig paralogous gen kopier.
Samlet gir vi en detaljert protokoll for omvendt genetisk analyse i P. andersonii. Ved hjelp av denne protokollen, kan enkelt mutant linjer effektivt genereres i en tidsramme på 2-3 måneder10. Denne protokollen kan utvides til å skape høyere orden mutanter gjennom multipleksing av sgRNAs målretting ulike gener samtidig, som vist for andre plantearter40,41,42. I tillegg er den stabile transformerings prosedyren som beskrives her, ikke begrenset til CRISPR/Cas9 gen målretting, men kan også brukes til å innføre andre typer konstruksjoner (f.eks. for promoter-reporter-analyser, svangerskap/formidling eller trans– komplementering). Vi etablerte P. andersonii som en komparativ forsknings modell for å studere mutualistic symbioses med nitrogen-fixing rhizobia eller endomycorrhizal sopp. Men protokollene beskrevet her også gi verktøy for å studere andre aspekter av biologi av dette tropiske treet, slik som tre dannelse, utvikling av bi-seksuelle blomster eller biosyntesen av Cannabaceae-spesifikke sekundære metabolitter.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne liker å anerkjenne Markus Youles, Sophien Kamoun og Sylvestre Marillonnet for å lage Golden Gate kloning deler tilgjengelig gjennom Addgene databasen. I tillegg vil vi gjerne takke E. James, P. Hadobas, og T. J. Higgens for p. andersonii frø. Dette arbeidet ble støttet av Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO-VICI Grant 865.13.001; NWO-åpen konkurranse stipend 819.01.007) og departementet for forskning, teknologi og høyere utdanning i republikken Indonesia (RISET-PRO Grant 8245-ID).
Sigma-Aldrich | N0640 | NAA |
Duchefa Biochemie | M1503.0250 | MES |
Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
Duchefa Biochemie | X1402.1000 | X-Gal |
Merck | 101236 | For nucleic acid electrophoresis gel |
– | – | Pouches box material, hangers |
Merck | 101188 | NH4NO3 |
Sigma-Aldrich | B3408-1G | BAP |
Merck | 100156 | H3BO3 |
Thermo-Fisher | ER1011 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly |
Thermo-Fisher | 15561020 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Merck | 137101 | CaCl2·2H2O |
Duchefa Biochemie | C0111.0025 | C16H16N5O7S2Na |
Thermo-Fisher | K1231 | Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure |
Agronutrition | AP2011 | Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay |
Merck | 102790 | CuSO4·5H2O |
Duchefa Biochemie | D1004.1000 | Used for plant tissue culture agar-based medium |
Merck | 105101 | K2HPO4 |
VWR Chemicals | 20302.293 | Na2·EDTA |
Duchefa Biochemie | M0803.1000 | C6H14O6 |
Thermo-Fisher | ER0291 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly |
Merck | 100983 | C2H5OH |
VWR Chemicals | BDH9232-500G | EDTA |
Sigma-Aldrich | Z377600-1PAK | Cellophane membrane |
Biomatters, Ltd. | R9 or higher | Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs |
Mega International | – | Technical information at https://mega-international.com/tech-info/ |
Sigma-Aldrich | 65882 | Used for fixating nodule tissues |
VWR Chemicals | 24385.295 | – |
Vink | 219341 | Pouches box material, bottom part |
Leica Biosystems | 14702218311 | Used as a template for plastic embedding |
Merck | 100317 | HCl |
Sigma-Aldrich | I5386-1G | IBA |
Merck | 103862 | C6H5FeO7 |
Merck | 103965 | FeSO4O·7H2O |
Duchefa Biochemie | I1401.0005 | IPTG |
Duchefa Biochemie | K0126.0010 | |
Sigma-Aldrich | L2000 | |
Merck | 105886 | MgSO4O·7H2O |
Merck | 105934 | MnCl2·4H2O |
Merck | 102786 | MnSO4O |
Duchefa Biochemie | M1002.1000 | Used for bacterial culture agar-based medium |
Manutan | 92007687 | Pouches material |
Paraxisdienst | 130774 | Elastic sealing foil |
Pull Rhenen | Agra-Perlite No.3 | Used as growing substrate in pots for nodulation assay |
VWR Chemicals | 391-0581 | Used as container for cellophane membranes |
Thermo-Fisher | F130WH | For genotyping transgenic lines |
Addgene | 50337 | Level 0 terminator, 3’UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus) |
Addgene | 48017 | End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor |
Addgene | 48018 | End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor |
Addgene | 48001 | Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation |
Addgene | 48007 | Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation |
Addgene | 50268 | Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5’UTR, Ω (Tobacco Mosaic Virus) |
Addgene | 46966 | Used for designing CRISPR/Cas9 module |
Addgene | 46968 | Used for designing CRISPR/Cas9 module |
Addgene | 50334 | Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette |
Topzeven | – | Used as filters for washing spore suspension |
Sigma-Aldrich | 8.17003 | PEG400 |
Duchefa Biochemie | E1674.0001 | Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings |
Merck | 104871 | KH2PO4 |
Merck | 105033 | KOH |
Merck | 105153 | K2SO4O |
Van Leusden b.v. | – | Used as growing substrate for mychorrhization assay |
Duchefa Biochemie | S0225.0050 | SH-basal salt medium |
Duchefa Biochemie | S0411.0250 | SH-vitamin mixture |
Lehle Seeds | VIS-02 | Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation |
Merck | 137017 | NaCl |
VWR Chemicals | 89230-072 | C6H11NaO7 |
Merck | 106521 | Na2MoO4·2H2O |
Merck | 106574 | Na2HPO4·7H2O |
Merck | 567549 | NaH2PO4·H2O |
Sigma-Aldrich | 239313 | Na2SO4O |
Duchefa Biochemie | S0809.5000 | C12H22O11 |
Thermo-Fisher | B69 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Thermo-Fisher | EL0013 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64708806 | Methyl methacrylate-based resin powder |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64709003 | HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 66022678 | Methyl methacrylate-based resin solution |
Merck | 1159300025 | |
Acros | 189350250 | |
VWR Chemicals | 663684B | Polysorbate 20 |
Stout Perspex | – | pouches box material, lid |
Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
Merck | 108816 | ZnCl2 |
Alfa Aesar | 33399 | ZnSO4O·7H2O |