Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças
Summary
São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.
Abstract
Manipular genes em células-tronco hematopoiéticas usando abordagens convencionais de transgénese pode ser demorado, caro e desafiador. Beneficiando-se de avanços na tecnologia de edição de genoma e sistemas de entrega de transgenes mediados por Lentivirus, um método eficiente e econômico é descrito aqui que estabelece camundongos em que os genes são manipulados especificamente em células-tronco hematopoiéticas. Os Lentivirus são usados para transduce células de medula óssea de linhagem negativa de expressão de Cas9 com um RNA guia (gRNA) visando genes específicos e um gene de repórter de fluorescência vermelha (RFP), então essas células são transplantadas em camundongos C57BL/6 irradiados de forma letal. Camundongos transplantados com Lentivirus expressando gRNA sem direcionamento são usados como controles. O Engraftment de pilhas de haste hematopoietic transvadas é avaliado pela análise citométrica do fluxo de leucócito RFP-positivos do sangue periférico. Usando este método, a transdução de ~ 90% de pilhas Myeloid e de ~ 70% de pilhas lymphoid em 4 semanas após a transplantação pode ser conseguida. O ADN de Genomic é isolado dos glóbulos RFP-positivos, e as porções do ADN alvejado do local são amplificadas pelo PCR para validar a edição do genoma. Este protocolo fornece uma avaliação da elevado-produção de genes hematopoiesis-reguladores e pode ser estendido a uma variedade de modelos da doença do rato com participação da pilha hematopoietic.
Introduction
Muitos estudos em Hematologia e Imunologia dependem da disponibilidade de camundongos geneticamente modificados, incluindo camundongos convencionais e condicionais transgênicos/knock-out que utilizam condutores de CRE específicos do sistema hematopoiéticos, como Mx1-CRE, vav-CRE e outros 1,2,3,4,5. Essas estratégias exigem o estabelecimento de novas cepas de camundongo, que podem ser demoradas e onerosas financeiramente. Embora os avanços revolucionários na tecnologia de edição de genoma tenham possibilitado a geração de novas cepas de mouse em apenas 3-4 meses com a expertise técnica apropriada6,7,8,9 , muito mais tempo é exigido para amplificar a colônia do rato antes que os experimentos sejam perseguidos. Além disso, esses procedimentos são dispendiosos. Por exemplo, Jackson Laboratory lista o preço atual dos serviços de geração de ratos knock-out em $16845 por cepa (a partir de dezembro de 2018). Assim, métodos mais econômicos e eficientes do que as abordagens transgênicas murinas convencionais são mais vantajosos.
As repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas/tecnologia CRISPR associada à proteína 9 (CRISPR/Cas9) levaram ao desenvolvimento de novas ferramentas para a edição de genoma rápida e eficiente baseada em RNA, sequência específica. Originalmente descoberto como um mecanismo imunológico adaptativo bacteriano para destruir o DNA do patógeno invasor, o sistema CRISPR/Cas9 tem sido usado como uma ferramenta para aumentar a eficácia da edição do genoma em células eucarióticas e modelos animais. Várias abordagens foram empregadas para a transmissão de máquinas CRISPR/Cas9 em células-tronco hematopoiéticas (i.e., eletroporação, nucleofecção, lipofecção, parto viral e outros).
Aqui, um sistema de Lentivirus é empregado para transduce as células devido à sua capacidade de infectar eficazmente as células tronco hematopoiéticas murinas que expressam a Cas9 e empacotar juntas a construção de expressão de RNA guia, promotores, sequências regulatórias e genes que codificam proteínas de repórter fluorescente (i.e., GFP, RFP). Usando este método, a edição ex vivo do gene de pilhas de haste Hematopoietic do rato foi conseguida, seguida pela reconstituição bem sucedida da medula em ratos letalmente irradiados10. O vetor do Lentivirus empregado para este estudo expressa os genes do repórter de Cas9 e de GFP do promotor comum do núcleo EF1a com um local ribosomal interno da entrada a montante do gene do repórter. A sequência de RNA guia é expressa a partir de um promotor U6 separado. Este sistema é usado então para criar mutações da inserção e do apagamento nos genes clonal do excitador do hematopoiese do candidato Tet2 e Dnmt3a10. No entanto, a eficiência de transdução por esse método é relativamente baixa (~ 5%-10%) devido ao grande tamanho da pastilha vetorial (13 kbp) que limita a eficiência de transdução e reduz o titer de vírus durante a produção.
Em outros estudos, demonstrou-se que o maior tamanho do RNA viral afeta negativamente a produção de vírus e a eficiência de transdução. Por exemplo, um aumento de 1 KB no tamanho da pastilha é relatado para diminuir a produção de vírus em ~ 50%, e a eficiência de transdução diminuirá para mais de 50% nas células-tronco hematopoiéticas do mouse11. Assim, é vantajoso para reduzir o tamanho da inserção viral, tanto quanto possível para melhorar a eficiência do sistema.
Essa lacuna pode ser superada empregando-se camundongos transgênicos de CAS9, nos quais a proteína CAS9 é expressa de forma constitutiva ou induzível12. Os ratos de batida constitutivos de CRISPR/Cas9 expressam o endonuclease Cas9 e o EGFP do promotor de CAG no locus Rosa26 em uma maneira onipresente. Assim, uma construção com sgRNA o controle do promotor U6 e gene repórter RFP o controle do promotor EF1a núcleo pode ser entregue usando o vetor de Lentivirus para alcançar a edição do genoma. Com este sistema, os genes de células-tronco hematopoiéticas foram editados com sucesso, mostrando uma eficiência de transdução de ~ 90%. Assim, este protocolo fornece um método rápido e eficaz para criar os ratos em que as mutações genéticas alvejadas são introduzidas no sistema hematopoietic. Enquanto nosso laboratório está usando predominantemente este tipo de tecnologia para estudar o papel da hematopoiese clonal emprocessos de doença cardiovascular13,14,4,15, tambémé aplicável a estudos de hematológicos malignidade16. Além disso, este protocolo pode ser estendido à análise de como as mutações do ADN em HSPC impactam a outra doença ou processos desenvolventes no sistema hematopoietic.
Para estabelecer um sistema robusto do vetor do Lentivirus, os estoques virais do Titer elevado e as condições aperfeiçoadas para a transdução e a transplantação de pilhas hematopoietic são exigidos. No protocolo, são fornecidas instruções sobre a preparação de um estoque viral de alto título na seção 1, otimizando as condições de cultura de células-tronco hematopoiéticas murinas na seção 2, métodos para transplante de medula óssea na seção 3, e avaliando Engraftment na secção 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
A vantagem deste protocolo é a criação de modelos animais que abriam mutações específicas em células hematopoiéticas de forma rápida e altamente rentável em comparação com as abordagens transgênicas convencionais do camundongo. Verificou-se que esta metodologia possibilita a geração de camundongos com manipulações de células hematopoiéticas dentro de 1 mês. Há diversas etapas críticas neste protocolo que exigem uma consideração mais adicional.
Triagem da sequên…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. S. foi apoiado por uma associação americana do coração pós-doutorado Fellowship 17POST33670076. K. W. foi apoiado por concessões de NIH R01 HL138014, R01 HL141256, e R01 HL139819.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
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