Количественные подходы для изучения клеточных структур и органеллы морфологии в Caenorhabditis elegans
Summary
В этом исследовании излагаются количественные измерения синаптических размеров и локализации, морфологии мышц и митохондриальной формы в C. elegans с использованием свободно доступных инструментов обработки изображений. Такой подход позволяет будущим исследованиям в C. elegans количественно сравнить степень структурных изменений тканей и органелл в результате генетических мутаций.
Abstract
Определение клеточных механизмов, лежащих в основе болезни имеет важное значение для развития новых терапевтических препаратов. Стратегия, часто используемая для распутывания этих механизмов, заключается в внедрении мутаций в генах-кандидатах и качественном описании изменений в морфологии тканей и клеточных органелл. Однако качественные описания могут не фиксировать тонкие фенотипические различия, могут искажать фенотипические вариации между отдельными лицами в популяции и часто оцениваются субъективно. Здесь описаны количественные подходы для изучения морфологии тканей и органелл в нематоде Caenorhabditis elegans с помощью лазерного сканирования конфокальной микроскопии в сочетании с коммерчески доступным программным обеспечением для обработки биоизображений. Для понимания был проведен количественный анализ фенотипов, влияющих на целостность синапсов (размер и интегрированные уровни флуоресценции), развитие мышц (размер мышечной клетки и длина нити миозинов) и митохондриальную морфологию (круговость и размер) влияние генетических мутаций на эти клеточные структуры. Эти количественные подходы не ограничиваются описанными здесь приложениями, поскольку они могут легко использоваться для количественной оценки морфологии других тканей и органелл в нематоде, а также в других типовых организмах.
Introduction
Нематод Caenorhabditis elegans (C. elegans) все чаще используется в качестве модели системы для выявления биологических и молекулярных процессов, участвующих в болезни человека. Взрослый нематод имеет длину тела чуть более 1 мм, и может производить большой выводок до 300 яиц1. После вылупления, C. elegans только требуется 3-4 дней, чтобы достичь совершеннолетия, и жить около 2 до 3 недель2. Из-за своей простоты культивирования, C. elegans в настоящее время является одним из самых востребованных моделей in vivo животных для проведения экономически эффективных, экспресс-скрининга наркотиков для выявления терапевтических средств для заболеваний человека. Кроме того, его генетическая консервация, четко определенные поведенческие парадигмы, прозрачное тело для флуоресценции или световой микроскопии, а также простота генетических манипуляций делают изучение клеточных и молекулярных последствий генетических мутаций легко достижимым 3. Геном C. elegans имеет около 60-80% оротологии с человеческими генами, и около 40% из этих генов, как известно, связаны с болезнью. Некоторые из человеческих заболеваний, которые были смоделированы и изучены в C. elegans включают нейродегенеративные расстройства (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, Шарко-Мари-Зубная болезнь), мышечные заболевания ( Мышечная дистрофия Дюшенна и метаболические заболевания(гипергликемия) 2,4. В большинстве человеческих расстройств происходят вызванные болезнями клеточные и органеллыи и морфологические изменения, которые легко оценить в модели нематод.
Флуоресцентные маркеры широко используются для обозначения тканей и органелл для динамической визуализации под микроскопом. Однако, в C. elegans, обычные методы, которые оценивают морфологические нарушения из-за генетических мутаций в значительной степени опирались на визуальные описания. В то время как качественные оценки могут охватывать более широкие диапазоны фенотипических описаний (синаптической морфологии, GFP слипания, конкретные аксональные формы, толщина мышечного волокна и т.д.) и обеспечить вид с высоты птичьего полета морфологических изменений, они менее хорошо подходят для сравнение небольших вариаций в разных группах. Кроме того, качественные оценки основаны на визуальной, субъективной оценке, которая может привести к чрезмерной или недооценке морфологических аномалий. Наконец, качественные наблюдения могут также сильно различаться между людьми, создавая трудности с репликацией данных.
В последние годы был разработан ряд удобных для пользователя вычислительных алгоритмов, которые могут количественно анализировать изображения. Тем не менее, использование такого программного обеспечения анализа изображений для некоторых морфологических исследований, особенно в отношении мышц стенки тела и митохондрий, в C. elegans исследования отстают. Для улучшения основных структурных анализов в C. elegans, некоторые из легко доступных, с открытым исходным кодом программного обеспечения анализа изображений были опробованы количественно сравнить влияние генетических мутаций на мышечные митохондрии, мышцы стены тела и синаптической Морфология. Эти экспериментальные процедуры подробно излагают, как эти программы (Фиджи, иластик, CellProfiler, СКВАСШ) могут быть использованы для оценки изменений в синаптических размерах и локализации синаптического белка, области мышц стены тела и длины клетчатки, а также митохондриальных размера и круговой связи в результате генетических мутаций в нематоде.
Protocol
Representative Results
Discussion
Морфологические вариации часто оценивались с помощью ручного подсчета заметных различий или использования произвольных пороговых значений для определения дефектов по сравнению с фенотипом дикого типа. Однако в последнее время для сравнительных исследований морфологии используютс?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников лаборатории Ноймана за ценные дискуссии и вклад. Некоторые штаммы были предоставлены CGC, которая финансируется NIH Управление научно-исследовательских инфраструктурных программ (P40 OD010440). Авторы благодарят WormBase за ее богатое количество информации о C. elegans, и признать Монаш Micro Imaging, Монаш университета, для предоставления приборов, обучение и техническую поддержку. Эта работа была поддержана cmTAA научно-исследовательских грантов (2015 и 2018), и NHMRC проект Гранты 1101974 и 1099690 присуждается B.N.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. . Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -. P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
