Enfoques cuantitativos para el estudio de las estructuras celulares y la morfología de los organélilos en Los cenoheman
Summary
Este estudio describe las mediciones cuantitativas del tamaño y localización sináptica, la morfología muscular y la forma mitocondrial en C. elegans utilizando herramientas de procesamiento de imágenes disponibles libremente. Este enfoque permite que estudios futuros en C. elegans comparen cuantitativamente la extensión de los cambios estructurales de tejidos y orgásis como resultado de mutaciones genéticas.
Abstract
Definir los mecanismos celulares subyacentes a la enfermedad es esencial para el desarrollo de nuevas terapias. Una estrategia que se utiliza con frecuencia para desentrañar estos mecanismos es introducir mutaciones en los genes candidatos y describir cualitativamente los cambios en la morfología de los tejidos y los orgánulos celulares. Sin embargo, las descripciones cualitativas pueden no capturar diferencias fenotípicas sutiles, pueden tergiversar variaciones fenotípicas entre individuos en una población y con frecuencia se evalúan subjetivamente. Aquí, se describen enfoques cuantitativos para estudiar la morfología de los tejidos y orgánulos en el nematodo Caenorhabditis elegans utilizando microscopía confocal de escaneo láser combinada con un software de procesamiento de bioimagen disponible comercialmente. Se realizó un análisis cuantitativo de fenotipos que afectan a la integridad de la sinapsis (tamaño y niveles de fluorescencia integrados), desarrollo muscular (tamaño de célula muscular y longitud del filamento de miosina) y morfología mitocondrial (circularidad y tamaño) para entender los efectos de las mutaciones genéticas en estas estructuras celulares. Estos enfoques cuantitativos no se limitan a las aplicaciones descritas aquí, ya que podrían utilizarse fácilmente para evaluar cuantitativamente la morfología de otros tejidos y orgánulos en el nematodo, así como en otros organismos modelo.
Introduction
El nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) se utiliza cada vez más como un sistema modelo para descubrir los procesos biológicos y moleculares involucrados en las enfermedades humanas. Un nematodo adulto tiene una longitud corporal de poco más de 1 mm, y puede producir una gran cría de hasta 300 huevos1. Después de la eclosión, C. elegans sólo requieren 3-4 días para llegar a la edad adulta, y vivir alrededor de 2 a 3 semanas2. Debido a su facilidad de cultivo, C. elegans es actualmente uno de los modelos animales in vivo más buscados para llevar a cabo pruebas de detección rápidas y rentables de medicamentos para identificar terapias para enfermedades humanas. Además, su conservación genética, paradigmas conductuales bien definidos, cuerpo transparente para fluorescencia o microscopía ligera, y facilidad de manipulación genética hacen que el estudio de las consecuencias celulares y moleculares de las mutaciones genéticas sea fácilmente alcanzable 3. El genoma de C. elegans comparte aproximadamente 60-80% de la ortología con genes humanos, y alrededor del 40% de esos genes se sabe que están relacionados con la enfermedad. Algunas de las enfermedades humanas que han sido modeladas y estudiadas en C. elegans incluyen trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth), enfermedades asociadas al músculo ( Distrofia muscular de Duchenne), y enfermedades metabólicas (hiperglucemia)2,4. En la mayoría de los trastornos humanos, se producen la localización celular y de los orgánulos inducida por la enfermedad y los cambios morfológicos, que pueden evaluarse fácilmente en el modelo de nematodos.
Los marcadores fluorescentes se han utilizado ampliamente para etiquetar tejidos y orgánulos para la visualización dinámica bajo el microscopio. Sin embargo, en C. elegans,los métodos convencionales que evalúan las irregularidades morfológicas debidas a mutaciones genéticas se han basado en gran medida en descripciones visuales. Si bien las evaluaciones cualitativas pueden abarcar rangos más amplios de descripciones fenotípicas (morfología sináptica, aglomeración gFP, forma axonal específica, grosor de la fibra muscular, etc.) y proporcionar una visión de pájaro de los cambios morfológicos, son menos adecuadas para comparando pequeñas variaciones entre diferentes grupos. Además, las evaluaciones cualitativas se basan en evaluaciones visuales y subjetivas, lo que puede dar lugar a sobreestimaciones o subestimaciones de anomalías morfológicas. Por último, las observaciones cualitativas también pueden variar mucho entre individuos, creando dificultades con la replicación de datos.
En los últimos años, se han desarrollado una serie de algoritmos computacionales fáciles de usar y fácilmente disponibles que pueden analizar cuantitativamente imágenes. Sin embargo, la utilización de este tipo de software de análisis de imágenes para algunos estudios morfológicos, especialmente en relación con los músculos de la pared del cuerpo y las mitocondrias, en C. elegans investigación se ha quedado atrás. Para mejorar el análisis estructural subyacente en C. elegans, se probaron algunos de los softwares de análisis de imágenes de código abierto fácilmente disponibles para comparar cuantitativamente los efectos de las mutaciones genéticas en las mitocondrias musculares, el músculo de la pared corporal y el sináptico Morfología. Estos procedimientos experimentales describen en detalle cómo estos programas (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) se pueden utilizar para evaluar los cambios en el tamaño sináptico y la localización de proteínas sinápticas, el área del músculo de la pared del cuerpo y la longitud de la fibra, y el tamaño mitocondrial y la circularidad como resultado de mutaciones genéticas en el nematodo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con frecuencia se han evaluado variaciones morfológicas mediante el recuento manual de diferencias notables o mediante umbrales arbitrarios para determinar defectos en comparación con un fenotipo de tipo salvaje. Más recientemente, sin embargo, se han utilizado métodos cuantitativos para estudios comparativos de morfología para medir y describir con precisión los cambios a nivel celular y subcelular de manera imparcial. La capacidad de identificar diferencias sutiles pero biológicamente relevantes entre fenotipos …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio Neumann por sus valiosos debates y aportaciones. Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que es financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Los autores agradecen a WormBase por su gran cantidad de información sobre C. elegans,y reconocen a Monash Micro Imaging, de la Universidad de Monash, por el suministro de instrumentación, capacitación y soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por las becas de investigación CMTAA (2015 y 2018), y las Becas de Proyectos NHMRC 1101974 y 1099690 otorgadas a B.N.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. . Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -. P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
