Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation
Summary
Hier wird ein vereinfachtes Standard-Betriebsverfahren für die Mikrobiom-Profilierung mit 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung und Analyse mit frei verfügbaren Werkzeugen beschrieben. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, die neu im Mikrobiom-Bereich sind, sowie solchen, die Aktualisierungen von Methoden benötigen, um bakterielleS Profiling mit einer höheren Auflösung zu erreichen.
Abstract
Der menschliche Darm wird von Billionen von Bakterien besiedelt, die physiologische Funktionen wie Lebensmittelstoffwechsel, Energiegewinnung und Regulierung des Immunsystems unterstützen. Die Störung des gesunden Darmmikrobioms wurde vorgeschlagen, eine Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Multipler Sklerose (MS), zu spielen. Umwelt- und genetische Faktoren können die Zusammensetzung des Mikrobioms beeinflussen; Daher ist die Identifizierung mikrobieller Gemeinschaften, die mit einem Perphänotyp der Krankheit verbunden sind, der erste Schritt zur Definition der Rolle des Mikrobioms bei Gesundheit und Krankheit. Die Verwendung von 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung zur Profilierung bakterieller Gemeinschaft hat dazu beigetragen, die Mikrobiomforschung voranzubringen. Trotz seiner breiten Verwendung gibt es kein einheitliches Protokoll für die 16S rRNA-basierte taxonomische Profiling-Analyse. Eine weitere Einschränkung ist die geringe Auflösung der taxonomischen Zuweisung aufgrund technischer Schwierigkeiten wie kleinere Sequenzierungslesevorgänge sowie die Verwendung von nur Vorwärts-Lesevorgängen (R1) in der Endanalyse aufgrund geringer Qualität von Reverse-Lesevorgängen (R2). Es bedarf einer vereinfachten Methode mit hoher Auflösung, um die bakterielle Vielfalt in einem bestimmten Bioprobe zu charakterisieren. Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie mit der Fähigkeit, längere Lesevorgänge mit hoher Auflösung zu sequenzieren, haben dazu beigetragen, einige dieser Herausforderungen zu meistern. Die gegenwärtige Sequenzierungstechnologie in Kombination mit einer öffentlich verfügbaren metagenomischen Analysepipeline wie R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) hat dazu beigetragen, die mikrobielle Profilierung bei hoher Auflösung voranzutreiben, da DADA2 Sequenzen an der Gattung zuweisen kann. und Artenniveaus. Hier wird eine Anleitung zur Durchführung der bakteriellen Profilierung mit zweistufiger Amplifikation der V3-V4-Region des 16S rRNA-Gens beschrieben, gefolgt von einer Analyse mit frei verfügbaren Analysewerkzeugen (d. h. DADA2, Phyloseq und METAGENassist). Es wird angenommen, dass dieser einfache und vollständige Workflow als ausgezeichnetes Werkzeug für Forscher dienen wird, die an der Durchführung von Mikrobiom-Profiling-Studien interessiert sind.
Introduction
Mikrobiota bezieht sich auf eine Sammlung von Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Archaeen, Bakteriophagen und Pilze), die in einer bestimmten Umgebung leben, und das Mikrobiom bezieht sich auf das kollektive Genom von ansässigen Mikroorganismen. Da Bakterien eine der häufigsten Mikroben bei Menschen und Mäusen sind, konzentriert sich diese Studie nur auf bakterielle Profilierung. Der menschliche Darm wird von Billionen von Bakterien und Hunderten von Bakterienstämmen1besiedelt. Die normale Darmmikrobiota spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines gesunden Zustands im Wirt durch die Regulierung von Funktionen (d. h. die Aufrechterhaltung einer intakten Darmbarriere, Nahrungsstoffwechsel, Energiehomöostase, Hemmung der Besiedlung durch pathogene Organismen, und Regulierung der Immunantworten)2,3,4,5. Kompositole Störungen der Darmmikrobiota (Darmdysbiose) wurden mit einer Reihe von menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich Magen-Darm-Erkrankungen6, Adipositas7,8, Schlaganfall9, Krebs10, Diabetes8,11, rheumatoide Arthritis12, Allergien13, und Erkrankungen des Zentralnervensystems wie Multiple Sklerose (MS)14,15 und Alzheimer Krankheit (AD)8,16. Daher ist in den letzten Jahren das Interesse an Werkzeugen zur Identifizierung der bakterienzusammensetzung an verschiedenen Körperstandorten gestiegen. Eine zuverlässige Methode sollte Eigenschaften wie hohe Durchsatz und einfach zu bedienen, mit der Fähigkeit, bakterielle Mikrobiota mit hoher Auflösung zu klassifizieren, und kostengünstig haben.
Kulturbasierte mikrobiologische Techniken sind nicht empfindlich genug, um das komplexe Darmmikrobiom zu identifizieren und zu charakterisieren, da mehrere Darmbakterien in der Kultur nicht wachsen. Das Aufkommen der Sequenzierungs-basierten Technologie, insbesondere der 16S rRNA-basierten metagenomischen Sequenzierung, hat einige dieser Herausforderungen überwunden und die Mikrobiomforschung transformiert17. Die fortschrittliche 16S rRNA-basierte Sequenzierungstechnologie hat dazu beigetragen, eine entscheidende Rolle für das Darmmikrobiom in der menschlichen Gesundheit zu etablieren. Das Human Microbiome Project, eine Initiative 18 der Nationalen Institute für Gesundheit18, und das MetaHIT-Projekt (eine europäische Initiative)19 haben beide dazu beigetragen, einen grundlegenden Rahmen für die Mikrobiomanalyse zu schaffen. Diese Initiativen halfen, mehrere Studien in Gang zu leiten, um die Rolle des Darmmikrobioms bei der menschlichen Gesundheit und Krankheit zu bestimmen.
Eine Reihe von Gruppen haben Darmdysbiose bei Patienten mit entzündlichen Erkrankungen gezeigt12,14,15,20,21,22. Obwohl es aufgrund der Fähigkeit zu Multiplex und niedrigen Kosten weit verbreitet für taxonomisches Profiling verwendet wird, gibt es keine einheitlichen Protokolle für 16S rRNA-basierte silyische Profilerstellung. Eine weitere Einschränkung ist die geringe Auflösung der taxonomischen Zuweisung aufgrund kleinerer Sequenzierungslesevorgänge (150 bp oder 250 bp) und die Verwendung von nur Vorwärtssequenzierungslese (R1) aufgrund von Reverse-Sequenzierungslesevorgängen (R2) geringer Qualität. Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie haben jedoch dazu beigetragen, einige dieser Herausforderungen zu überwinden, wie z. B. die Möglichkeit, längere Lesevorgänge mit Paired-End-Lesevorgängen zu sequenzieren (z. B. Illumina MiSeq 2x300bp).
Die derzeitige Sequenzierungstechnologie kann 600 bp gute Lesequalität sequenzieren, was das Zusammenführen von R1- und R2-Lesevorgängen ermöglicht. Diese zusammengeführten längeren R1- und R2-Lesevorgänge ermöglichen bessere taxonomische Zuweisungen, insbesondere mit offener R-basierter Stritten-Amplicon-Denoising-Algorithmus-2-Plattform (DADA2). DADA2 verwendet Amplicon-Sequenzvarianten (ASV)-basierte Zuweisungen anstelle von Operativen taxonomischen Einheiten (OTU)-Zuweisungen basierend auf 97% Ähnlichkeit, die von QIIME23verwendet wird. ASV-Matches ergeben eine exakte Sequenzübereinstimmung in der Datenbank innerhalb von 1:2-Nukleotiden, was zu einer Zuordnung auf Gattungs- und Artenebene führt. Daher haben die Kombination aus längeren, qualitativ hochwertigen Paired-End-Lesevorgängen und besseren taxonomischen Zuweisungswerkzeugen (wie DADA2) Mikrobiomstudien transformiert.
Hier ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Durchführung von bakteriellen Profilierung mit zweistufiger Verstärkung der V3-V4-Region von 16S rRNA und Datenanalyse mit DADA2, Phyloseq und METAGENassist Pipelines. Für diese Studie werden transgene Mäuse des humanen Leukozytenantigens (HLA) der Klasse II verwendet, da bestimmte ÖsA-Klasse-II-Allele mit einer Veranlagung für Autoimmunerkrankungen wie MS20,24,25verbunden sind. Die Bedeutung von HLA-Genen der Klasse II bei der Regulierung der Zusammensetzung von Darmmikrobiota ist jedoch unbekannt. Es wird vermutet, dass das Molekül der HLA-Klasse II die mikrobielle Darmgemeinschaft beeinflussen wird, indem es für bestimmte Bakterien ausgewählt wird. Major Histocompatibility Complex (MHC) Class II Knockout Mäuse (AE.KO) oder Mäuse, die menschliche HLA-DQ8 Moleküle (HLA-DQ8)24,25,26 verwendeten, um die Bedeutung von HLA-Klasse-II-Molekülen in die Mikrobengemeinschaft des Darms zu formen. Es wird angenommen, dass dieser vollständige und vereinfachte Workflow mit R-basierter Datenanalyse als ausgezeichnetes Werkzeug für Forscher dienen wird, die an der Durchführung von Mikrobiom-Profiling-Studien interessiert sind.
Die Generation von Mäusen ohne endogene murine MHC-Genen der Klasse II (AE.KO) und AE-/-. HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) transgene Mäuse mit einem C57BL/6J Hintergrund wurden zuvor26beschrieben. Fäkalproben werden von Mäusen beiderlei Geschlechts (8-12 Wochen alt) entnommen. Mäuse wurden zuvor in der Tieranlage der University of Iowa gemäß den NIH- und institutionellen Richtlinien gezüchtet und gepflegt. Kontaminationskontrollstrategien wie das Entwöhnen der Mäuse in einem laminaren Strömungsschrank, der Wechsel von Handschuhen zwischen verschiedenen Mäusestämmen und die ordnungsgemäße Pflege von Mäusen sind entscheidende Schritte für die Profilierung von Darmmikrobiom.
Die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA) wird während des gesamten Eingriffs dringend empfohlen. Bei der Durchführung von DNA-Isolation, PCR1- und PCR2-Verstärkung und Sequenzierungsschritten sollten geeignete negative Kontrollen einbezogen werden. Die Verwendung von sterilen, DNase-freien, RNase-freien und pyrogenfreien Vorräten wird empfohlen. Ausgewiesener Pipettiertor für Mikrobiomarbeit und gefilterte Pipettenspitzen sollten im gesamten Protokoll verwendet werden. Die Mikrobiota-Analyse besteht aus sieben Schritten: 1) Sammlung und Verarbeitung von Fäkalienproben; 2) Extraktion von DNA; 3) 16S rRNA Genverstärkung; 4) DNA-Bibliotheksbau mit indizierter PCR; 5) Bereinigung und Quantifizierung der indizierten PCR (Bibliothek); 6) MiSeq-Sequenzierung; und 7) Datenverarbeitung und Sequenzanalyse. Ein schematisches Diagramm aller Protokollschritte ist in Abbildung 1dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll ist einfach, mit einfach zu befolgenden Schritten, um Mikrobiom-Profiling mit 16S rRNA metagenomische Sequenzierung aus einer großen Anzahl von Biospecimenn von Interesse durchzuführen. Die Sequenzierung der nächsten Generation hat mikrobielle Ökologiestudien transformiert, insbesondere in den Modellen für menschliche und präklinische Krankheiten31,32. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Fähigkeit, komplexe mikrobielle Zusam…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die Finanzierung durch das NIAID/NIH (1R01AI137075-01), den Carver Trust Medical Research Initiative Grant und das University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| 1.5 ml Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
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