抗体喂养方法研究分离原发性希马培养物中的谷氨酸受体贩运
Summary
本文提出了一种研究分离原发海马培养物的谷氨酸受体(GluR)贩运的方法。使用抗体喂养方法将内源性或过度表达的受体与药理学方法相结合,该方法允许通过调节来识别调节GluR表面表达的分子机制内部化或回收过程。
Abstract
细胞对外部刺激的反应严重依赖在给定时刻在细胞表面表达的受体组。因此,表面表达受体的种群不断适应,并受到严格的调节机制的制约。生物学中研究最多的贩运事件是谷氨酸受体(GluRs)突触表达的调节控制。GluRs调解中枢神经系统的绝大多数兴奋性神经传递,并控制突触和神经元水平(例如,突触可塑性)的生理活动依赖性功能和结构变化。表面表达的GluRs的数量、位置和亚单位成分的修改深刻地影响神经元功能,事实上,这些因素的变化与不同的神经病变有关。这里介绍的是一个研究分离海马原神经元的GluR贩运的方法。”抗体喂养”方法用于对表面和内膜表示的 GluR 群体进行差异可视化。通过在活细胞上标记表面受体并在不同时间固定它们,以便受体内分泌和/或循环利用,可以评估并选择性地研究这些贩运过程。这是一个多功能的协议,可以结合药理学方法或过度表达改变的受体,以获得有关影响GluR贩运的刺激和分子机制的宝贵信息。同样,它可以很容易地适应研究其他受体或表面表达的蛋白质。
Introduction
细胞利用贩运的活性过程来将蛋白质动员到特定的亚细胞定位中,并对其功能进行严格的时空调节1。这个过程对于跨膜受体尤其重要,因为细胞对不同环境刺激的反应依赖于受体激活触发的细胞内级联。细胞可以通过改变受体亚细胞贩运调节2在细胞表面表达的受体的密度、定位和亚单位组成来改变这些反应。将新合成的受体插入血浆膜,以及内分泌和现有受体的循环利用,是确定表面表达受体2的净池的贩运过程的例子。许多分子机制合作调节蛋白质贩运,包括蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰,如磷酸化、泛化或棕榈化2。
在结构高度专业化的强极化细胞中,特别需要调节受体贩运。典型的例子是通过调节贩运谷氨酸受体(GluRs)控制神经元功能3,4。谷氨酸,主要兴奋神经递质,结合和激活表面表达的GluRs,以控制基本的生理神经元功能,如突触神经传递和突触可塑性。从神经发育障碍到神经退行性疾病,在广泛的神经病变中观察到了改变的GluR贩运,这一事实凸显了这个过程的重要性5。因此,了解控制GluR贩运的分子事件在许多研究领域是值得关注的。
在此协议中,使用基于抗体馈送的方法量化原海马神经元表面表达的GluRs水平,并评估内化和再循环的变化如何导致观察到的净表面表达。使用药理学和/或过度表达具有特定突变的外源受体,使该协议成为研究神经元适应不同环境刺激的分子机制的一种特别有力的方法。该协议效用的最后一个例子是研究环境中的多因素变化(如疾病模型中)通过检查此类模型中的表面表达如何影响 GluR 贩运。
使用具体的例子,初步演示了模仿生理突触刺激的药理学操作[化学LTP(cLTP)]如何增加AMPA型GluRs(AMPARs)内源性GluA1亚单位的表面表达6.还分析了NMDA型GluRs(NmDARs)的GluN2B亚单位的过度表达磷-模拟形式的贩运,以说明如何利用该协议研究特定翻译后对GluR贩运的管制修改。虽然使用这些具体的例子,该协议可以很容易地应用于其他GluRs和其他受体和蛋白质,具有抗原细胞外域。如果没有可用于细胞外域的抗体,过度表达细胞外表位标记(例如,标记、Myc-、GFP 标记等)蛋白质有助于蛋白质标记。
当前协议提供了使用特定抗体量化特定 GluR 亚型密度和贩运的说明。该协议可用于研究 1) 总 GluR 表面表达,2) GluR 内化,以及 3) GluR 回收。要单独研究每个过程,建议从第 1 节和第 2 节开始,然后继续第 3、4 或 5 节。在所有情况下,以第 6 和 8 节结束 (图 1)。
Protocol
Representative Results
Discussion
细胞与其环境之间的相互作用(例如,与其他细胞的沟通、对不同刺激的反应等)在很大程度上依赖于细胞表面受体的正确表达。表面表达受体含量的快速和微调调节使细胞能够对不断变化的环境做出适当的反应。在神经元的特殊情况下,合成表达受体的数量、定位和亚单位组成的变化严重影响突触交流、突触可塑性、突触发生和突触修剪3, 5,<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢西北高级显微镜中心使用尼康A1共聚焦显微镜,并协助规划和分析实验。这项研究得到了NIGMS(T32GM008061)和NIA(R00AG041225)以及脑与行为研究基金会(#24133)的NARSAD青年调查员资助。
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
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