En antistof fodring tilgang til at studere glutamat receptor handel i dissocierede primære hippocampus kulturer
Summary
Denne artikel præsenterer en metode til at studere glutamat receptor (GluR) handel med dissocierede primære hippocampus kulturer. Ved hjælp af en antistof-fodring tilgang til at mærke endogene eller over udtrykte receptorer i kombination med farmakologiske tilgange, denne metode giver mulighed for identifikation af molekylære mekanismer regulerer GluR overflade ekspression ved at moduere internaliserings-eller genanvendelsesprocesser.
Abstract
Cellulære reaktioner på eksterne stimuli er stærkt afhængige af det sæt af receptorer, der udtrykkes ved cellens overflade på et givet tidspunkt. Derfor er populationen af overflade-udtrykte receptorer konstant tilpasning og underlagt strenge reguleringsmekanismer. Det paradigmatiske eksempel og en af de mest studerede menneskehandel begivenheder i biologi er den regulerede kontrol af det synaptiske udtryk af glutamat receptorer (GluRs). GluRs mægle langt størstedelen af excitatoriske neurotransmission i det centrale nervesystem og kontrollere fysiologiske aktivitets afhængige funktionelle og strukturelle ændringer på den synaptiske og neuronal niveauer (f. eks, synaptisk plasticitet). Ændringer i antallet, placering, og underenhed sammensætning af overflade udtrykt glurs dybt påvirke neuronal funktion og, i virkeligheden, ændringer i disse faktorer er forbundet med forskellige neuropatier. Præsenteret her er en metode til at studere GluR handel i dissocierede hippocampus primære neuroner. En “antistof-fodring” tilgang anvendes til differentielt visualisere GluR populationer udtrykt ved overfladen og indre membraner. Ved at mærkning overflade receptorer på levende celler og fastsættelse dem på forskellige tidspunkter for at give mulighed for receptorer endokytose og/eller genanvendelse, disse menneskehandel processer kan evalueres og selektivt undersøgt. Dette er en alsidig protokol, der kan anvendes i kombination med farmakologiske tilgange eller over ekspression af ændrede receptorer for at få værdifuld information om stimuli og molekylære mekanismer, som påvirker GluR-handel. Tilsvarende kan det let tilpasses til at studere andre receptorer eller overflade udtrykte proteiner.
Introduction
Celler udnytter den aktive proces af menneskehandel til at mobilisere proteiner til specifikke subcellulære lokaliseringer og udøve streng spatiotemporale regulering over deres funktion1. Denne proces er især vigtigt for transmembran receptorer, som cellulære reaktioner på forskellige miljømæssige stimuli stole på intracellulære kaskader udløst af receptor aktivering. Celler er i stand til at ændre disse reaktioner ved at ændre tæthed, lokalisering, og underenhed sammensætning af receptorer udtrykt ved cellens overflade via receptor subcellulære handel regulation2. Indsættelse af nyligt syntetiserede receptorer i plasma membranen, sammen med endokytose og genanvendelse af eksisterende receptorer er eksempler på menneskehandel processer, der bestemmer netto puljen af overflade-udtrykte receptorer2. Mange molekylære mekanismer samarbejder om at regulere protein smugling, herunder protein-protein interaktioner og posttranslationelle modifikationer såsom fosforylering, allestedsnærværende eller palmitoylering2.
Regulering af receptor handel er især påkrævet i stærkt polariserede celler med højt specialiserede strukturer. Det paradigmatiske eksempel er kontrol af neuronal funktion af reguleret handel med glutamat receptorer (glurs)3,4. Glutamat, den vigtigste excitatoriske neurotransmitter, binder og aktiverer overflade-udtrykte glurs til at kontrollere grundlæggende fysiologiske neuronal funktioner såsom synaptisk neurotransmission og synaptisk plasticitet. Den kendsgerning, at ændret GluR-handel er blevet observeret i et bredt spektrum af neuropatier, der spænder fra neuroudviklingsmæssige lidelser til neurodegenerative sygdomme, fremhæver betydningen af denne proces5. Således forståelse af de molekylære begivenheder, der kontrollerer GluR handel er af interesse i mange områder af forskning.
I denne protokol anvendes en antistoffodrings baseret metode til at kvantificere niveauet af overflade-udtrykte GluRs i primær hippocampus neuroner samt evaluere, hvordan ændringer i internalisering og genanvendelse resulterer i den observerede netto overflade ekspression. Brugen af farmakologi og/eller overekspression af eksogene receptorer harkedeligt specifikke mutationer gør denne protokol en særlig kraftfuld tilgang til at studere molekylære mekanismer underliggende neuronal tilpasning til forskellige miljømæssige stimuli. Et sidste eksempel på nytten af denne protokol er at undersøge, hvordan multifaktorielle ændringer i miljøet (f. eks. i en sygdomsmodel) påvirker GluR-handel gennem undersøgelse af overflade ekspression i sådanne modeller.
Ved hjælp af specifikke eksempler, det er i første omgang demonstreret, hvordan en farmakologisk manipulation efterligner fysiologiske synaptisk stimulation [Chemical LTP (cltp)] øger overflade ekspression af den endogene GluA1 underenhed af AMPA-type af glurs (ampars) 6. ulovlig handel med overudtrykt phospho-mimetisk form af GluN2B underenhed af NMDA-type af GluRs (NMDARs) analyseres også for at eksemplificere, hvordan denne protokol kan anvendes til at studere reguleringen af GluR-handel ved specifikke posttranslationelle Ændringer. Selv om disse specifikke eksempler anvendes, denne protokol kan nemt anvendes til andre GluRs og andre receptorer og proteiner, der besidder antigene ekstracellulære domæner. I tilfælde af, at der ikke er antistoffer til rådighed for ekstracellulære domæner, over ekspression af ekstracellulære epitope-Tagged (f. eks flag-, MYC-, GFP-Tagged, etc.) proteiner kan hjælpe med protein mærkning.
Den nuværende protokol indeholder anvisninger til kvantificering af specifik GluR-subtype tæthed og handel med specifikke antistoffer. Denne protokol kan anvendes til at studere 1) total GluR overflade ekspression, 2) GluR internalisering, og 3) GluR genanvendelse. For at studere hver proces individuelt, anbefales det at begynde med afsnit 1 og 2 og fortsætte med enten afsnit 3, 4 eller 5. I alle tilfælde afsluttes med punkt 6 og 8 (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Interaktionen mellem en celle og dens omgivelser (f. eks. kommunikation med andre celler, respons på forskellige stimuli osv.) er stærkt afhængig af det korrekte udtryk af receptorer ved cellens overflade. Den hurtige og finjusterede regulering i overflade udtrykt receptor indhold muliggør korrekt cellulær respons på et miljø i konstant forandring. I det særlige tilfælde af neuroner, ændringer i antallet, lokalisering, og underenhed sammensætning af synaptisk udtrykte receptorer stærkt påvirker synaptisk kom…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker nordvestlige Center for avanceret mikroskopi til brug af Nikon a1 Confocal mikroskop og deres assistance i planlægning og analyse af eksperimenter. Denne forskning blev støttet af NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), og NIA (R00AG041225) og en NARSAD Young Investigator Grant fra hjernen & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
- Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
- Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
- Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
- Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
- Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).
