Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen
Summary
Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.
Abstract
Cellulaire reacties op externe stimuli sterk vertrouwen op de set van receptoren uitgedrukt in het celoppervlak op een bepaald moment. Dienovereenkomstig, de populatie van oppervlakte-uitgedrukte receptoren is voortdurend aan te passen en onderworpen aan strenge mechanismen van regulering. Het paradigmatische voorbeeld en een van de meest bestudeerde evenementen in de biologie is de gereguleerde controle van de synaptische expressie van glutamaat receptoren (GluRs). GluRs bemiddelen de overgrote meerderheid van de excitatory transmissie in het centrale zenuwstelsel en controle fysiologische activiteit-afhankelijke functionele en structurele veranderingen op de synaptische en neuronale niveaus (bijv., synaptische plasticiteit). Wijzigingen in het aantal, de locatie en de subeenheid samenstelling van het oppervlak uitgedrukt glurs diep beïnvloeden neuronale functie en, in feite, wijzigingen in deze factoren worden geassocieerd met verschillende neuropathieën. Hier gepresenteerd is een methode om glur-handel in gezien hippocampal primaire neuronen te bestuderen. Een “antilichaam-voedende” benadering wordt gebruikt voor het differentieel visualiseren van GluR populaties uitgedrukt op het oppervlak en inwendige membranen. Door het labelen van de oppervlakte-receptoren op levende cellen en het oplossen van hen op verschillende tijdstippen voor receptoren endocytose en/of recycling, deze handel processen kunnen worden geëvalueerd en selectief bestudeerd. Dit is een veelzijdig protocol dat kan worden gebruikt in combinatie met farmacologische benaderingen of overexpressie van veranderde receptoren om waardevolle informatie te verkrijgen over stimuli en moleculaire mechanismen die de handel in GluR beïnvloeden. Evenzo, het kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van andere receptoren of oppervlakte uitgedrukt eiwitten.
Introduction
Cellen maken gebruik van het actieve proces van handel om eiwitten te mobiliseren voor specifieke subcellulaire lokalisaties en het uitoefenen van strikte spatiotemporele regulering over hun functie1. Dit proces is vooral belangrijk voor transmembraan receptoren, als cellulaire reacties op verschillende milieu stimuli vertrouwen op intracellulaire Cascades veroorzaakt door receptor activering. Cellen zijn in staat om deze reacties te wijzigen door het veranderen van de dichtheid, lokalisatie, en subeenheid samenstelling van receptoren uitgedrukt op het celoppervlak via receptor subcellulaire handel voorschrift2. Het inbrengen van nieuw worden receptoren in het plasma membraan, samen met endocytose en recycling van bestaande receptoren zijn voorbeelden van mensenhandel processen die bepalen de netto pool van oppervlakte-uitgedrukt receptoren2. Veel moleculaire mechanismen werken samen om de eiwit handel te reguleren, waaronder eiwit-eiwit interacties en posttranslationele modificaties zoals fosforylering, Ubiquitination of palmitoylation2.
Regulering van de receptor handel is met name vereist in sterk gepolariseerde cellen met zeer gespecialiseerde structuren. Het paradigmatische voorbeeld is de controle van neuronale functie door gereguleerde handel in glutamaat receptoren (glurs)3,4. Glutamaat, de belangrijkste excitatory neurotransmitter, bindt en activeert oppervlak-uitgedrukt GluRs voor het beheersen van fundamentele fysiologische neuronale functies zoals synaptische transmission en synaptische plasticiteit. Het feit dat veranderde GluR handel is waargenomen in een breed spectrum van neuropathieën, variërend van neuroontwikkelingsstoornissen tot neurodegeneratieve ziekten, benadrukt het belang van dit proces5. Het begrijpen van de moleculaire gebeurtenissen die de handel in GluR beheersen, is dus interessant voor veel onderzoeksgebieden.
In dit protocol wordt een methode op basis van antilichamen gebruikt om het niveau van oppervlakte-uitgedrukt GluRs in primaire hippocampale neuronen te kwantificeren en te evalueren hoe veranderingen in internalisatie en recycling resulteren in de waargenomen netto-oppervlakte uitdrukking. Het gebruik van farmacologie en/of overexpressie van exogene receptoren die specifieke mutaties verteren maakt dit protocol een bijzonder krachtige benadering voor het bestuderen van moleculaire mechanismen onderliggende neuronale aanpassing aan verschillende milieu stimuli. Een laatste voorbeeld van het nut van dit protocol is het bestuderen van de invloed van de multifactoriële veranderingen in het milieu (zoals in een ziekte model) op de handel in GluR door het onderzoek van de oppervlakte expressie in dergelijke modellen.
Met behulp van specifieke voorbeelden, het is in eerste instantie aangetoond hoe een farmacologische manipulatie nabootsen van fysiologische synaptische stimulatie [Chemical LTP (cLTP)] verhoogt de oppervlakte uitdrukking van de endogene GluA1 subeenheid van de AMPA-type van GluRs (AMPARs) 6. de handel in een overuitgedrukt fosho-mimetische vorm van de GluN2B subeenheid van het NMDA-type GluRs (NMDARs) wordt ook geanalyseerd om te illustreren hoe dit protocol kan worden gebruikt om de regulering van de GluR-handel te bestuderen door specifieke posttranslationele Wijzigingen. Hoewel deze specifieke voorbeelden worden gebruikt, kan dit protocol gemakkelijk worden toegepast op andere gluren en andere receptoren en eiwitten die antigene extracellulaire domeinen bezitten. In het geval dat er geen antilichamen beschikbaar zijn voor extracellulaire domeinen, overexpressie van extracellulaire epitope-Tagged (bijv., vlag-, Myc-, GFP-Tagged, enz.) eiwitten kunnen helpen bij de etikettering van eiwitten.
Het huidige protocol bevat instructies voor het kwantificeren van specifieke GluR-subtype dichtheid en mensenhandel met specifieke antilichamen. Dit protocol kan worden gebruikt om te bestuderen 1) totaal GluR oppervlakte expressie, 2) GluR internalisatie, en 3) GluR recycling. Om elk proces afzonderlijk te bestuderen, wordt geadviseerd om te beginnen met de secties 1 en 2 en door te gaan met sectie 3, 4 of 5. In alle gevallen, eindig met secties 6 en 8 (Figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
De interactie tussen een cel en zijn omgeving (bijv. communicatie met andere cellen, reactie op verschillende stimuli, enz.) is sterk afhankelijk van de juiste expressie van receptoren op het celoppervlak. De snelle en fijngetunede regulering in oppervlakte-uitgedrukt receptor inhoud zorgt voor een goede cellulaire reactie op een voortdurend veranderende omgeving. In het specifieke geval van neuronen, wijzigingen in het aantal, lokalisatie, en de samenstelling van de subeenheid van Synaptisch uitgedrukt receptoren sterk …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken het noordwestelijke centrum voor geavanceerde microscopie voor het gebruik van de Nikon a1 confocale Microscoop en hun hulp bij het plannen en analyseren van de experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) en NIA (R00AG041225) en een NARSAD Young Investigator subsidie van de Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
- Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
- Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
- Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
- Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
- Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).
