Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen
Summary
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels (GluR) in dissoziierten primären Hippocampuskulturen vor. Mit einem Antikörper-Fütterungsansatz zur Kennzeichnung endogenes oder überexprimierter Rezeptoren in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen ermöglicht diese Methode die Identifizierung molekularer Mechanismen zur Regulierung der GluR-Oberflächenexpression durch Modulation Internalisierungs- oder Recyclingprozesse.
Abstract
Zelluläre Reaktionen auf äußere Reize hängen stark von der Reihe von Rezeptoren ab, die zu einem bestimmten Zeitpunkt an der Zelloberfläche ausgedrückt werden. Dementsprechend passt sich die Population der oberflächenausgedrückten Rezeptoren ständig an und unterliegt strengen Regulationsmechanismen. Das paradigmatische Beispiel und eines der am meisten untersuchten Handelsereignisse in der Biologie ist die regulierte Kontrolle der synaptischen Expression von Glutamatrezeptoren (GluRs). GluRs vermitteln die überwiegende Mehrheit der exzitatorischen Neurotransmission im zentralen Nervensystem und steuern physiologische aktivitätsabhängige funktionelle und strukturelle Veränderungen auf synaptischer und neuronaler Ebene (z. B. synaptische Plastizität). Veränderungen in der Anzahl, Lage und UntereinheitZusammensetzung der Oberfläche ausgedrückt GluRs tief beeinflussen neuronale Funktion und in der Tat, Veränderungen in diesen Faktoren sind mit verschiedenen Neuropathien verbunden. Präsentiert hier ist eine Methode zur Untersuchung des GluR-Handels mit dissoziierten Hippocampus-Primärneuronen. Ein “Antikörper-Feeding”-Ansatz wird verwendet, um GluR-Populationen, die an der Oberfläche und den inneren Membranen ausgedrückt werden, differenziell zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren auf lebenden Zellen und deren Fixierung zu unterschiedlichen Zeitpunkten, um Rezeptoren-Endozytose und/oder Recycling zu ermöglichen, können diese Handelsprozesse evaluiert und selektiv untersucht werden. Dies ist ein vielseitiges Protokoll, das in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen oder Überexpression veränderter Rezeptoren verwendet werden kann, um wertvolle Informationen über Reize und molekulare Mechanismen zu gewinnen, die den GluR-Handel beeinflussen. In ähnlicher Weise kann es leicht angepasst werden, um andere Rezeptoren oder oberflächenausgedrückte Proteine zu untersuchen.
Introduction
Zellen nutzen den aktiven Prozess des Menschenhandels, um Proteine zu bestimmten subzellulären Lokalisationen zu mobilisieren und eine strenge raumzeitliche Regulierung über ihre Funktion auszuüben1. Dieser Prozess ist besonders wichtig für Transmembran-Rezeptoren, da zelluläre Reaktionen auf verschiedene Umweltreize auf intrazellulären Kaskaden beruhen, die durch Dieoraktivierung ausgelöst werden. Zellen sind in der Lage, diese Reaktionen zu ändern, indem sie die Dichte, Lokalisierung und Zusammensetzung der Untereinheiten von Rezeptoren ändern, die an der Zelloberfläche über die subzelluläre HandelsverordnungdesRezeptors 2 ausgedrückt werden. Das Einsetzen von neu synthetisierten Rezeptoren in die Plasmamembran, zusammen mit Endozytose und Recycling bestehender Rezeptoren sind Beispiele für Menschenhandelsprozesse, die den Netzpool von oberflächenausgedrückten Rezeptoren bestimmen2. Viele molekulare Mechanismen arbeiten zusammen, um den Proteinhandel zu regulieren, einschließlich Protein-Protein-Wechselwirkungen und posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung, Ubiquitination oder Palmitoylierung2.
Die Regulierung des Rezeptorhandels ist insbesondere in stark polarisierten Zellen mit hochspezialisierten Strukturen erforderlich. Das paradigmatische Beispiel ist die Kontrolle der neuronalen Funktion durch regulierten Handel mit Glutamatrezeptoren (GluRs)3,4. Glutamat, der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter, bindet und aktiviert oberflächenexprimierte GluRs, um grundlegende physiologische neuronale Funktionen wie synaptische Neurotransmission und synaptische Plastizität zu steuern. Die Tatsache, dass veränderter GluR-Handel in einem breiten Spektrum von Neuropathien beobachtet wurde, von neuroentwicklungsbedingten Störungen bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen, unterstreicht die Bedeutung dieses Prozesses5. Daher ist das Verständnis der molekularen Ereignisse, die den GluR-Handel kontrollieren, in vielen Forschungsbereichen von Interesse.
In diesem Protokoll wird eine Antikörper-Fütterungsmethode verwendet, um den Gehalt an oberflächenausgedrückten GluRs in primären Hippocampus-Neuronen zu quantifizieren und zu bewerten, wie Veränderungen der Internalisierung und des Recyclings zur beobachteten Nettooberflächenexpression führen. Die Verwendung von Pharmakologie und/oder Überexpression von exogenen Rezeptoren mit spezifischen Mutationen macht dieses Protokoll zu einem besonders leistungsfähigen Ansatz für die Untersuchung molekularer Mechanismen, die der neuronalen Anpassung an verschiedene Umweltreize zugrunde liegen. Ein letztes Beispiel für den Nutzen dieses Protokolls ist die Untersuchung, wie sich multifaktorielle Veränderungen in der Umwelt (z. B. bei Krankheitsmodellen) durch die Untersuchung der Oberflächenexpression in solchen Modellen auf den GluR-Handel auswirkt.
Anhand spezifischer Beispiele wird zunächst demonstriert, wie eine pharmakologische Manipulation, die physiologische synaptische Stimulation imitiert [chemische LTP (cLTP)] die Oberflächenexpression der endogenen GluA1-Untereinheit des AMPA-Typs von GluRs (AMPARs) erhöht. 6. Der Handel mit einer überexprimierten phospho-mimetischen Form der GluN2B-Untereinheit von GluRs (NMDARs) vom Typ NMDA wird ebenfalls analysiert, um zu veranschaulichen, wie dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Regulierung des GluR-Handels durch spezifische posttranslationale Änderungen. Obwohl diese spezifischen Beispiele verwendet werden, kann dieses Protokoll leicht auf andere GluRs und andere Rezeptoren und Proteine angewendet werden, die antigene extrazelluläre Domänen besitzen. Für den Fall, dass keine Antikörper für extrazelluläre Domänen verfügbar sind, können Überexpression von extrazellulären Epitop-Tags (z. B. Flag-, Myc-, GFP-taggt, etc.) Proteine bei der Proteinkennzeichnung helfen.
Das aktuelle Protokoll enthält Anweisungen zur Quantifizierung der spezifischen GluR-Subtypdichte und des Menschenhandels mit spezifischen Antikörpern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um 1) die gesamte GluR-Oberflächenexpression, 2) GluR-Internalisierung und 3) GluR-Recycling zu untersuchen. Um jeden Prozess einzeln zu studieren, wird empfohlen, mit den Abschnitten 1 und 2 zu beginnen und entweder mit Abschnitt 3, 4 oder 5 fortzufahren. In allen Fällen mit den Abschnitten 6 und 8 beenden (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Interaktion zwischen einer Zelle und ihrer Umgebung (z. B. Kommunikation mit anderen Zellen, Reaktion auf unterschiedliche Reize usw.) beruht stark auf der korrekten Expression von Rezeptoren an der Zelloberfläche. Die schnelle und fein abgestimmte Regulierung des oberflächenausgedrückten Rezeptorinhalts ermöglicht eine angemessene zelluläre Reaktion auf eine sich ständig verändernde Umgebung. Im besonderen Fall von Neuronen, Veränderungen in der Anzahl, Lokalisierung und Untereinheit Zusammensetzung der syna…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Northwestern Center for Advanced Microscopy für den Einsatz des Nikon A1 Konfokalmikroskops und deren Unterstützung bei der Planung und Analyse der Experimente. Diese Forschung wurde von NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) und NIA (R00AG041225) und einem NARSAD Young Investigator Grant von der Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.) unterstützt.
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
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