अलग प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृति में ग्लूटामेट रिसेप्टर तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक एंटीबॉडी खिला दृष्टिकोण
Summary
यह लेख अलग प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों में ग्लूटामेट रिसेप्टर (GluR) तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। औषधीय दृष्टिकोण के साथ संयोजन में अंतर्जात या overexpressed रिसेप्टर्स लेबल करने के लिए एक एंटीबॉडी खिला दृष्टिकोण का उपयोग करना, इस विधि नियमन द्वारा GluR सतह अभिव्यक्ति को विनियमित आणविक तंत्र की पहचान के लिए अनुमति देता है आंतरिककरण या रीसाइक्लिंग प्रक्रियाओं.
Abstract
बाह्य उद्दीपकों के लिए कोशिकीय प्रक्रियाएँ किसी दिए गए क्षण में कोशिका पृष्ठ पर व्यक्त अभिग्राहियों के समुच्चय पर भारी निर्भर करती हैं। तदनुसार, सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप्टर्स की आबादी लगातार अनुकूलन और विनियमन के सख्त तंत्र के अधीन है. प्रतिमानात्मक उदाहरण और जीव विज्ञान में सबसे अधिक अध्ययन तस्करी की घटनाओं में से एक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (GluRs) के synaptic अभिव्यक्ति के विनियमित नियंत्रण है. GluRs केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में उत्तेजक न्यूरोसंचरण के विशाल बहुमत मध्यस्थता और synaptic और न्यूरॉन स्तर पर शारीरिक गतिविधि पर निर्भर कार्यात्मक और संरचनात्मक परिवर्तन नियंत्रण (उदाहरण के लिए, synaptic प्लास्टिक). सतह की संख्या, स्थान, और उपइकाई संरचना में संशोधन GluRs गहराई से न्यूरॉन समारोह को प्रभावित और, वास्तव में, इन कारकों में परिवर्तन विभिन्न neuropathies के साथ जुड़े रहे हैं. यहाँ प्रस्तुत अलग हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन्स में GluR तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक विधि है. एक “एंटीबॉडी-फीडिंग” दृष्टिकोण का उपयोग सतह और आंतरिक झिल्ली पर व्यक्त ग्लूआर आबादी को अंतर-विज़ुअल कल्पना करने के लिए किया जाता है। जीवित कोशिकाओं पर सतह रिसेप्टर्स लेबलिंग और उन्हें अलग अलग समय पर फिक्सिंग रिसेप्टर्स endocytosis और / यह एक बहुमुखी प्रोटोकॉल है कि औषधीय दृष्टिकोण या बदल रिसेप्टर्स के overexpression के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है उत्तेजनाओं और GluR तस्करी को प्रभावित करने वाले आणविक तंत्र के बारे में बहुमूल्य जानकारी हासिल है. इसी तरह, यह आसानी से अन्य रिसेप्टर्स या सतह व्यक्त प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Introduction
सेल विशिष्ट उपकोशिकीय स्थानीयकरणों में प्रोटीन जुटाने के लिए अवैध व्यापार की सक्रिय प्रक्रिया का उपयोग करते हैं और उनके कार्य1पर सख्त स्पैटियोटेम्पोरल विनियमन लागू करते हैं . इस प्रक्रिया transmembrane रिसेप्टर्स के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, के रूप में विभिन्न पर्यावरण उत्तेजनाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं रिसेप्टर सक्रियण द्वारा ट्रिगर intracellular cascades पर भरोसा करते हैं. सेल रिसेप्टर subcellular तस्करी विनियमन2के माध्यम से सेल सतह पर व्यक्त रिसेप्टर्स के घनत्व, स्थानीयकरण, और subunit संरचना बदलकर इन प्रतिक्रियाओं को संशोधित करने में सक्षम हैं. प्लाज्मा झिल्ली में नए synthetized रिसेप्टर्स की प्रविष्टि, endocytosis और मौजूदा रिसेप्टर्स के रीसाइक्लिंग के साथ तस्करी प्रक्रियाओं है कि सतह expressed रिसेप्टर्स2के शुद्ध पूल का निर्धारण के उदाहरण हैं. कई आणविक तंत्र प्रोटीन तस्करी को विनियमित करने के लिए सहयोग करते हैं, जिसमें प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत और फॉस्फोरिलेशन, सर्वव्यापकता, या पामिटोयलेशन2जैसे पोस्टट्रांसल संशोधन शामिल हैं।
रिसेप्टर तस्करी के विनियमन विशेष रूप से अत्यधिक विशेष संरचनाओं के साथ दृढ़ता से polarized कोशिकाओं में आवश्यक है. प्रतिमानात्मक उदाहरण ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के विनियमित तस्करी द्वारा न्यूरोनल समारोह का नियंत्रण है (GluRs)3,4. ग्लूटामेट, मुख्य उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर, बांधता है और इस तरह के synaptic neurotransmission और synaptic प्लास्टिक के रूप में मौलिक शारीरिक न्यूरॉन कार्यों को नियंत्रित करने के लिए सतह expressed GluRs सक्रिय करता है. तथ्य यह है कि परिवर्तित GluR तस्करी neuropathies के एक व्यापक स्पेक्ट्रम में देखा गया है, neurodevelopmental विकारों से neurodegenerative रोगों को लेकर, इस प्रक्रिया के महत्व पर प्रकाश डाला गया5. इस प्रकार, GLUR तस्करी को नियंत्रित करने वाली आणविक घटनाओं को समझना अनुसंधान के कई क्षेत्रों में रुचि का है।
इस प्रोटोकॉल में, एक एंटीबॉडी खिला आधारित विधि प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में सतह-एक्सप्रेस्ड ग्लूआर के स्तर को निर्धारित करने के साथ-साथ यह मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है कि मनाया शुद्ध सतह अभिव्यक्ति में आंतरिककरण और रीसाइक्लिंग परिणाम में परिवर्तन कैसे होता है। विशेष उत्परिवर्तनों को आश्रय देने वाले बाह्य जनजन रिसेप्टर्स के औषध विज्ञान और/या अतिअभिव्यक्ति का उपयोग इस प्रोटोकॉल को विभिन्न पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के लिए न्यूरॉन अनुकूलन के अंतर्निहित आणविक तंत्र ों के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से शक्तिशाली दृष्टिकोण बनाता है। इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता का एक अंतिम उदाहरण अध्ययन कर रहा है कि कैसे पर्यावरण में बहुकारक परिवर्तन (जैसे एक रोग मॉडल में) ऐसे मॉडलों में सतह अभिव्यक्ति की परीक्षा के माध्यम से GluR तस्करी को प्रभावित करता है.
विशिष्ट उदाहरणों का उपयोग करके, यह शुरू में दिखाया जाता है कि कैसे एक फार्माकोलॉजिक हेरफेर शारीरिक synaptic उत्तेजना नकल [रासायनिक LTP (cLTP)] GLURs के AMPA-प्रकार के अंतर्जात GluA1 उपइकाई की सतह अभिव्यक्ति बढ़ जाती है (AMPARs) 6.NMDA-प्रकार के ग्लूआर (NMDARs) के GluN2B subunit के GluN2B subunit के एक overexpressed फॉस्फो-मिमेटिक रूप की तस्करी भी उदाहरण के लिए विश्लेषण किया जाता है कि कैसे इस प्रोटोकॉल विशिष्ट posttranslational द्वारा GluR तस्करी के विनियमन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संशोधन. हालांकि इन विशिष्ट उदाहरण का उपयोग किया जाता है, इस प्रोटोकॉल आसानी से अन्य GluRs और अन्य रिसेप्टर्स और प्रोटीन है कि antigenic extracellular डोमेन के अधिकारी के लिए लागू किया जा सकता है. मामले में है कि वहाँ कोई antibodies extracellular डोमेन के लिए उपलब्ध हैं, extracellular epitope-टैग (उदाहरण के लिए, झंडा, Myc-, GFP टैग, आदि) प्रोटीन लेबलिंग में सहायता कर सकते हैं की overexpression.
वर्तमान प्रोटोकॉल विशिष्ट GluR उपप्रकार घनत्व और विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर तस्करी की मात्रा निर्धारित करने के लिए निर्देश प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता 1) कुल GluR सतह अभिव्यक्ति, 2) GluR internalization, और 3) GluR रीसाइक्लिंग. प्रत्येक प्रक्रिया का व्यक्तिगत रूप से अध्ययन करने के लिए, यह 1 और 2 अनुभाग के साथ शुरू करने और या तो अनुभाग 3, 4, या 5 के साथ जारी रखने के लिए सलाह दी जाती है। सभी मामलों में, अनुभाग 6 और 8 (चित्र 1) के साथ समाप्त करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सेल और उसके पर्यावरण के बीच बातचीत (उदा., अन्य कोशिकाओं के साथ संचार, विभिन्न उत्तेजनाओं, आदि के लिए प्रतिक्रिया), भारी सेल सतह पर रिसेप्टर्स की सही अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है. सतह-एक्सप्रेस्ड रिसेप?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Nikon A1 Confocal माइक्रोस्कोप और योजना और प्रयोगों का विश्लेषण करने में उनकी सहायता के उपयोग के लिए उन्नत माइक्रोस्कोपी के लिए नॉर्थवेस्टर्न सेंटर धन्यवाद. इस शोध NIGMS (T32GM008061) (ए एम सी), और एनआईए (R00AG041225) और मस्तिष्क और व्यवहार अनुसंधान फाउंडेशन (#24133) (ए एस -सी) से एक NARSAD युवा अन्वेषक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
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