解離された原発性海馬培養におけるグルタミン酸受容体の密売を研究するための抗体摂食アプローチ
Summary
この記事では、解離された一次海馬培養におけるグルタミン酸受容体(GluR)の人身売買を研究する方法を紹介する。この方法は、内因性または過剰発現受容体を薬理学的アプローチと組み合わせて標識する抗体供給アプローチを用いて、変調によってGluR表面発現を調節する分子機構の同定を可能にする。内部化またはリサイクルプロセス。
Abstract
外部刺激に対する細胞応答は、所定の瞬間に細胞表面で発現される受容体のセットに大きく依存する。したがって、表面発現受容体の集団は常に適応し、規制の厳格なメカニズムに従います。パラダイムの例と生物学で最も研究された人身売買イベントの一つは、グルタミン酸受容体(GluR)のシナプス発現の調節制御です。GluRsは、中枢神経系における興奮性神経伝達の大部分を媒介し、シナプスおよび神経レベル(例えば、シナプス可塑性)における生理活性依存的機能的および構造的変化を制御する。GLURを発現した表面の数、位置、およびサブユニット組成の変化は、神経機能に深く影響を及ぼし、実際には、これらの因子の変化は異なる神経因果関係に関連している。ここで提示される解離海馬原発性ニューロンにおけるGluR人身売買を研究する方法である。「抗体供給」アプローチは、表面および内部膜で発現されるGluR集団を差別的に可視化するために使用される。生細胞に表面受容体を標識し、異なる時間に固定して受容体のエンドサイトシスおよび/またはリサイクルを可能にすることで、これらの人身売買プロセスを評価し、選択的に研究することができます。これは、GluRの人身売買に影響を与える刺激および分子メカニズムに関する貴重な情報を得るために、薬理学的アプローチまたは改変された受容体の過剰発現と組み合わせて使用することができる汎用性の高いプロトコルです。同様に、他の受容体または表面発現タンパク質を研究するために容易に適合させることができる。
Introduction
細胞は、特定の細胞内局在度にタンパク質を動員し、その機能1に対して厳格な時空間調節を行うために、人身売買のアクティブなプロセスを利用する。異なる環境刺激に対する細胞応答は、受容体活性化によって引き起こされる細胞内カスケードに依存するように、このプロセスは、膜受容体にとって特に重要です。細胞は、受容体細胞内取引調節規則2を介して細胞表面で発現される受容体の密度、局在化、およびサブユニット組成を変化させることによって、これらの応答を修飾することができる。新たに合成された受容体を血漿膜に挿入し、既存の受容体のエンドサイトーシスおよびリサイクルと共に、表面発現受容体2のネットプールを決定する人身売買プロセスの例である。多くの分子機構は、タンパク質とタンパク質の相互作用やリン酸化、ユビキキテーション、またはパルミトイル化2などの翻訳後修飾を含むタンパク質の密売を調節するために協力する。
受容体の人身売買の調節は、高度に特殊化された構造を有する強い偏分細胞において特に必要とされる。パラダイムの例は、グルタミン酸受容体(GluR)3、4の規制された人身売買による神経機能の制御である。グルタミン酸は、主な興奮性神経伝達物質であり、シナプス神経伝達およびシナプス可塑性などの基本的な生理的神経機能を制御するために表面発現GluRを結合し、活性化する。変化したGluR人身売買が神経発達障害から神経変性疾患に至るまで、神経障害の広いスペクトルで観察されているという事実は、このプロセス5の重要性を強調している。したがって、GluRの人身売買を制御する分子事象を理解することは、研究の多くの分野で興味深い。
このプロトコルでは、抗体供給ベースの方法を使用して、一次海馬ニューロンにおける表面発現GLURのレベルを定量化し、内部化およびリサイクルの変化が観察された正味表面発現にどのように生じるかを評価する。特定の変異を持つ外因性受容体の薬理学および/または過剰発現の使用は、このプロトコルが異なる環境刺激に対するニューロン適応の基礎となる分子メカニズムを研究するための特に強力なアプローチになります。このプロトコルの有用性の最終的な例は、このようなモデルにおける表面発現の検査を通じて、環境の多因子変化(疾患モデルなど)がGluRの人身売買にどのように影響するかを調べている。
具体的な例を用いて、生理シナプス刺激を模倣する薬理学的操作[化学LTP(cLTP)]がAMPA型GluR(AMPA)の内因性GluA1サブユニットの表面発現を増加させる方法を最初に実証する。6.NMDA型GluR(NMA)のGluN2Bサブユニットの過剰発現リン模倣形態の人身売買も分析され、このプロトコルが特定の翻訳後のGluR人身売買の規制を研究するためにどのように使用できるかを示す。変更。これらの特定の例が使用されるが、このプロトコルは、抗原細胞外ドメインを有する他のGluRおよび他の受容体およびタンパク質に容易に適用することができる。細胞外ドメインに利用可能な抗体がない場合、細胞外エピトープタグ付き(例えば、フラグ、Myc-、GFPタグなど)タンパク質の過剰発現は、タンパク質標識を助けることができる。
現在のプロトコルは、特定のGluRサブタイプ密度を定量し、特定の抗体を使用して人身売買を行うための指示を提供する。このプロトコルは、1)総GluR表面発現、2)GluR内部化、および3)GluRリサイクルを研究するために利用することができる。各プロセスを個別に学習するには、セクション 1 と 2 から始め、セクション 3、4、または 5 のいずれかに進むことをお勧めします。いずれの場合も、セクション 6 と 8 (図1) で終了します。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞とその環境との相互作用(例えば、他の細胞との通信、異なる刺激への応答など)は、細胞表面における受容体の正しい発現に大きく依存する。表面発現受容体含有量の迅速かつ微調整された調節は絶えず変化する環境への適切な細胞応答を可能にする。ニューロンの特定のケースでは、シナプス発現受容体の数、局在化、およびサブユニット組成の変化は、シナプス伝達、シナプス可塑?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ニコンA1共焦点顕微鏡の使用と実験の計画と分析における彼らの支援のためのノースウェスタン先端顕微鏡センターに感謝します。本研究は、NIGMS(T32GM008061)(A.M.C.)、NIA(R00AG041225)、および脳行動研究財団(#24133)のNARSAD若手研究者助成金(A. S.
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
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