Подход к кормлению антител для изучения торговли рецепторами глутамата в диссоциированных первичных гиппокампальных культурах
Summary
В этой статье представлен метод изучения глутаматных рецепторов (GluR) в разъединенных первичных гиппокампальных культурах. Используя подход к кормлению антител для маркировки эндогенных или переэкспрессированных рецепторов в сочетании с фармакологическими подходами, этот метод позволяет выявлять молекулярные механизмы, регулирующие экспрессию поверхности ГлюР путем модулирования процессов интернализации или рециркуляции.
Abstract
Клеточные реакции на внешние раздражители в значительной степени полагаются на набор рецепторов, выраженных на поверхности клетки в данный момент. Соответственно, популяция поверхностно выраженных рецепторов постоянно адаптируется и подчиняется строгим механизмам регулирования. Парадигматический пример и один из наиболее изученных событий торговли людьми в биологии является регулируемый контроль синаптической экспрессии рецепторов глутамата (GluRs). GluRs посредничают в подавляющем большинстве возбуждающих нейротрансмиссии в центральной нервной системе и контролируют физиологическую активность-зависимые функциональные и структурные изменения на синаптических и нейрональных уровнях (например, синаптической пластичности). Изменения в количестве, местоположении и составе субъединиц поверхности, выраженные Глюры, глубоко влияют на функцию нейронов и, по сути, изменения в этих факторах связаны с различными невропатиями. Представлено здесь метод для изучения GluR торговли в диссоциированных гиппокампа первичных нейронов. Подход «кормления антител» используется для дифференциализации популяций ГлюР, выраженных на поверхности и внутренних мембранах. Путем маркировки поверхностных рецепторов на живых клетках и фиксируя их на разное время для того чтобы позволить для приемных устройств endocytosis and/or рециркулировать, эти процессы торговли можно оценить и селективно изучить. Это универсальный протокол, который может быть использован в сочетании с фармакологическими подходами или переэкспрессией измененных рецепторов, чтобы получить ценную информацию о стимулах и молекулярных механизмах, влияющих на торговлю GluR. Аналогичным образом, он может быть легко адаптирован для изучения других рецепторов или поверхностных протеинов.
Introduction
Клетки используют активный процесс торговли, чтобы мобилизовать белки к конкретным субклеточным локализациям и осуществлять строгую пространственно-временное регулирование над их функцией1. Этот процесс особенно важен для трансмембранных рецепторов, так как клеточные реакции на различные экологические стимулы опираются на внутриклеточные каскады, вызванные активацией рецепторов. Клетки способны изменять эти реакции, изменяя плотность, локализацию и состав субъединиц рецепторов, выраженных на поверхности клетки через регулирование субклеточного оборота рецепторов2. Вставка вновь синтезированных рецепторов в плазменную мембрану, наряду с эндоцитозом и рециркуляцией существующих рецепторов являются примерами процессов торговли людьми, которые определяют чистый пул поверхностно выраженных рецепторов2. Многие молекулярные механизмы сотрудничают для регулирования торговли белками, включая белково-белковые взаимодействия и постпереводные модификации, такие как фосфорилирование, убиквитинация или пальмитоилация2.
Регулирование оборота рецепторов особенно необходимо в сильно поляризованных клетках с узкоспециализированными структурами. Парадигматический пример является контроль нейронной функции регулируемой торговли рецепторами глутамата (GluRs)3,4. Глутамат, основной возбуждательный нейромедиатор, связывает и активирует поверхностно-выраженные GluRs для управления фундаментальными физиологическими нейрональными функциями, такими как синаптической нейротрансмиссии и синаптической пластичности. Тот факт, что измененный клей торговли наблюдается в широком спектре невропатий, начиная от нейроразвития расстройств нейродегенеративных заболеваний, подчеркивает важность этого процесса5. Таким образом, понимание молекулярных событий, контролирующих торговлю GluR, представляет интерес во многих областях исследований.
В этом протоколе метод кормления антител используется для количественной оценки уровня поверхностных глюров в первичных гиппокампальных нейронах, а также для оценки того, как изменения в интернализации и рециркуляции приводят к наблюдаемому чистому экспрессии поверхности. Использование фармакологии и/или переэкспрессии экзогенных рецепторов, укрывающих специфические мутации, делает этот протокол особенно мощным подходом к изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе нейронной адаптации к различным экологическим стимулам. Последним примером полезности этого протокола является изучение того, как многофакторные изменения в окружающей среде (например, в моделях заболеваний) влияют на торговлю GluR путем изучения поверхностного выражения в таких моделях.
Используя конкретные примеры, первоначально показано, как фармакологические манипуляции, имитирующие физиологическую синаптической стимуляции (cLTP) увеличивает поверхностное выражение эндогенного подразделения GluA1 амрац-типа GluRs (AMPARs) 6.Торговля чрезмерно выраженной фосфо-миметической формой подразделения GluN2B NMDA-типа GluRs (NMDARs) также анализируется для примера того, как этот протокол может быть использован для изучения регулирования оборота ГлюР конкретными постпереводами Изменения. Хотя эти конкретные примеры используются, этот протокол может быть легко применен к другим GluRs и других рецепторов и белков, которые обладают антигенными внеклеточными доменами. В случае, если нет антител, доступных для внеклеточных доменов, переэкспрессия внеклеточных эпитопных меток (например, флаг-, Myc-, GFP-тегами и т.д.) белки могут помочь в маркировке белка.
В настоящем протоколе содержатся инструкции по количественной оценке конкретной плотности подтипов GluR и оборота с использованием конкретных антител. Этот протокол может быть использован для изучения 1) общего выражения поверхности GluR, 2) интернализации GluR и 3) переработки GluR. Для изучения каждого процесса индивидуально рекомендуется начинать с разделов 1 и 2 и продолжать либо раздел 3, 4, или 5. Во всех случаях, закончить с разделами 6 и 8(Рисунок 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Взаимодействие между клеткой и ее окружающей средой (например, общение с другими клетками, реакция на различные раздражители и т.д.), в значительной степени зависит от правильного выражения рецепторов на поверхности клетки. Быстрая и отлаженная регуляция содержания поверхностных реце?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Северо-Западный центр расширенной микроскопии за использование микроскопа Nikon A1 Confocal и их помощь в планировании и анализе экспериментов. Это исследование было поддержано NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), и NIA (R00AG041225) и ГРАНТом для молодых исследователей NARSAD от Фонда исследований мозга и поведения (#24133) (A. S. -C.).
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
- Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
- Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
- Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
- Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
- Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).
