Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados
Summary
Este artículo presenta un método para estudiar el tráfico de receptores de glutamato (GluR) en cultivos hipocampales primarios disociados. Utilizando un enfoque de alimentación de anticuerpos para etiquetar receptores endógenos o sobreexpresados en combinación con enfoques farmacológicos, este método permite la identificación de mecanismos moleculares que regulan la expresión superficial de GluR modulando procesos de internalización o reciclaje.
Abstract
Las respuestas celulares a los estímulos externos dependen en gran medida del conjunto de receptores expresados en la superficie celular en un momento dado. En consecuencia, la población de receptores expresados en superficie se está adaptando constantemente y sujeta a estrictos mecanismos de regulación. El ejemplo paradigmático y uno de los eventos de tráfico más estudiados en biología es el control regulado de la expresión sináptica de los receptores de glutamato (GluR). Los GluR median la gran mayoría de la neurotransmisión excitatoria en el sistema nervioso central y controlan los cambios funcionales y estructurales dependientes de la actividad fisiológica a los niveles sináptico y neuronal (por ejemplo, plasticidad sináptica). Las modificaciones en el número, la ubicación y la composición de la subunidad de los GluR expresados en superficie afectan profundamente la función neuronal y, de hecho, las alteraciones en estos factores se asocian con diferentes neuropatías. Presentado aquí es un método para estudiar el tráfico de GluR en las neuronas primarias del hipocampo disociadas. Se utiliza un enfoque de “alimentación de anticuerpos” para visualizar diferencialmente las poblaciones de GluR expresadas en la superficie y las membranas internas. Mediante el etiquetado de receptores de superficie en células vivas y la fijación en diferentes momentos para permitir la endotosis de receptores y / o reciclaje, estos procesos de tráfico pueden ser evaluados y estudiados selectivamente. Este es un protocolo versátil que se puede utilizar en combinación con enfoques farmacológicos o sobreexpresión de receptores alterados para obtener información valiosa sobre los estímulos y mecanismos moleculares que afectan el tráfico de GluR. Del mismo modo, se puede adaptar fácilmente para estudiar otros receptores o proteínas expresadas en la superficie.
Introduction
Las células utilizan el proceso activo de tráfico para movilizar proteínas a localizaciones subcelulares específicas y ejercer una estricta regulación espaciotemporal sobre su función1. Este proceso es especialmente importante para los receptores transmembrana, ya que las respuestas celulares a diferentes estímulos ambientales dependen de cascadas intracelulares desencadenadas por la activación del receptor. Las células son capaces de modificar estas respuestas alterando la densidad, localización y composición de subunidades de los receptores expresada en la superficie celular a través de la regulación del tráfico subcelular de receptores2. La inserción de receptores recién sintetizados en la membrana plasmática, junto con la endocitosis y el reciclaje delos receptores existentes son ejemplos de procesos de tráfico que determinan el conjunto neto de receptores expresados en superficie 2. Muchos mecanismos moleculares cooperan para regular el tráfico de proteínas, incluidas las interacciones proteína-proteína y las modificaciones posttranslacionales, como la fosforilación, la ubiquitinación o la palmitoylación2.
La regulación del tráfico de receptores es particularmente necesaria en células fuertemente polarizadas con estructuras altamente especializadas. El ejemplo paradigmático es el control de la función neuronal mediante el tráfico regulado de receptores de glutamato (GluRs)3,4. El glutamato, el principal neurotransmisor excitatorio, se une y activa los GluRs expresados por la superficie para controlar las funciones neuronales fisiológicas fundamentales como la neurotransmisión sináptica y la plasticidad sináptica. El hecho de que se haya observado el tráfico de GluR alterado en un amplio espectro de neuropatías, que van desde trastornos del neurodesarrollo hasta enfermedades neurodegenerativas, pone de relieve la importancia de este proceso5. Por lo tanto, entender los eventos moleculares que controlan el tráfico de GluR es de interés en muchas áreas de investigación.
En este protocolo, se utiliza un método basado en la alimentación de anticuerpos para cuantificar el nivel de GluRs expresados por la superficie en las neuronas primarias del hipocampo, así como evaluar cómo los cambios en la internalización y el reciclaje dan lugar a la expresión de superficie neta observada. El uso de farmacología y/o sobreexpresión de receptores exógenos que albergan mutaciones específicas hace de este protocolo un enfoque particularmente poderoso para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a la adaptación neuronal a diferentes estímulos ambientales. Un ejemplo final de la utilidad de este protocolo es estudiar cómo los cambios multifactoriales en el medio ambiente (como en los modelos de una enfermedad) afectan el tráfico de GluR a través del examen de la expresión superficial en estos modelos.
Utilizando ejemplos específicos, inicialmente se demuestra cómo una manipulación farmacológica imitando la estimulación sináptica fisiológica [LTP químico (cLTP)] aumenta la expresión superficial de la subunidad Endógena GluA1 del tipo AMPA de GluRs (AMPARs) 6. El tráfico de una forma fosfomimética sobreexpresada de la subunidad GluN2B de GluRs de tipo NMDA (NMDAR) también se analiza para ejemplificar cómo este protocolo puede utilizarse para estudiar la regulación del tráfico de GluR por Modificaciones. Aunque se utilizan estos ejemplos específicos, este protocolo se puede aplicar fácilmente a otros GluRs y otros receptores y proteínas que poseen dominios extracelulares antigénicos. En el caso de que no haya anticuerpos disponibles para dominios extracelulares, la sobreexpresión de proteínas extracelulares etiquetadas con epítopos (por ejemplo, Flag-, Myc-, GFP-tagged, etc.) puede ayudar en el etiquetado de proteínas.
El protocolo actual proporciona instrucciones para cuantificar la densidad específica de subtipos GluR y el tráfico utilizando anticuerpos específicos. Este protocolo se puede utilizar para estudiar 1) expresión total de la superficie GluR, 2) internalización de GluR, y 3) reciclaje de GluR. Para estudiar cada proceso individualmente, se aconseja comenzar con las secciones 1 y 2 y continuar con las secciones 3, 4 o 5. En todos los casos, termine con las secciones 6 y 8 (Figura1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La interacción entre una célula y su entorno (por ejemplo, la comunicación con otras células, la respuesta a diferentes estímulos, etc.), depende en gran medida de la expresión correcta de los receptores en la superficie celular. La regulación rápida y ajustada en el contenido del receptor expresado en la superficie permite una respuesta celular adecuada a un entorno en constante cambio. En el caso particular de las neuronas, las alteraciones en el número, la localización y la composición de subunidades de los…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Northwestern Center for Advanced Microscopy por el uso del microscopio Nikon A1 Confocal y su asistencia en la planificación y análisis de los experimentos. Esta investigación fue apoyada por NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), y NIA (R00AG041225) y una Beca de Investigador Joven NARSAD de la Fundación de Investigación del Cerebro y el Comportamiento (#24133) (A. S. -C.).
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
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