En antikropps matning metod för att studera glutamat-Receptorhandel i dissocierade primära hippocampal kulturer
Summary
Den här artikeln presenterar en metod för att studera handel med glutamatreceptorer (GluR) i dissocierade primära Hippocampus kulturer. Med hjälp av en metod för antikropps matning för att märka endogena eller överuttryckta receptorer i kombination med farmakologiska metoder, möjliggör denna metod identifiering av molekylära mekanismer som reglerar GluR-ytans uttryck genom att modulera processer för internalisering eller återvinning.
Abstract
Cellulära svar på yttre stimuli är starkt beroende av den uppsättning av receptorer som uttrycks på cellytan vid en given tidpunkt. Följaktligen är befolkningen i ytan-uttryckta receptorer ständigt anpassar sig och omfattas av strikta mekanismer för reglering. Det paradigmatiska exemplet och en av de mest studerade människohandel händelserna i biologi är den reglerade kontrollen av det synaptiska uttrycket av glutamatreceptorer (GluRs). GluRs förmedlar de allra flesta excitatoriska neurotransmission i centralanervsystemet och kontrollera fysiologiska aktivitet-beroende funktionella och strukturella förändringar på Synaptic och neuronala nivåer (t. ex., synaptisk plasticitet). Ändringar i antal, plats och subenhet sammansättning av ytan uttryckt glurs påverkar djupt neuronala funktion och, i själva verket, förändringar i dessa faktorer är förknippade med olika neuropatier. Presenteras här är en metod för att studera GluR trafficking i dissocierade Hippocampus primära nervceller. En “antikropps matning” metod används för att Differentiellt visualisera GluR populationer uttrycks på ytan och inre membran. Genom att märka ytan receptorer på levande celler och fastställa dem vid olika tidpunkter för att möjliggöra receptorer endocytos och/eller återvinning, dessa människohandel processer kan utvärderas och selektivt studeras. Detta är ett mångsidigt protokoll som kan användas i kombination med farmakologiska metoder eller överuttryck av förändrade receptorer för att få värdefull information om stimuli och molekylära mekanismer som påverkar GluR-handeln. På samma sätt, det kan lätt anpassas för att studera andra receptorer eller ytan uttrycks proteiner.
Introduction
Celler utnyttjar den aktiva processen för människohandel för att mobilisera proteiner till specifika subcellulära lokaliseringar och utöva strikt spatiotemporal reglering över sin funktion1. Denna process är särskilt viktigt för transmembranreceptorer, som cellulära svar på olika miljömässiga stimuli förlitar sig på intracellulära kaskader utlöses av receptor aktivering. Celler kan ändra dessa svar genom att ändra täthet, lokalisering, och subenhet sammansättning av receptorer uttrycks på cellytan via receptor subcellulära människohandel regulation2. Införandet av nyligen syntetiserade receptorer i plasmamembranet, tillsammans med endocytos och återvinning av befintliga receptorer är exempel på människohandel processer som avgör nätet pool av ytan-uttryckta receptorer2. Många molekylära mekanismer samverkar för att reglera protein handel, inklusive protein-protein interaktioner och posttranslationella modifieringar såsom fosforylering, ubiquitination, eller palmitoylation2.
Regleringen av receptor handel krävs bestämt i starkt polariserade celler med högt specialiserade strukturerar. Det paradigmatiska exemplet är kontrollen av neuronala funktion genom reglerad handel med glutamatreceptorer (glurs)3,4. Glutamat, den huvudsakliga excitatoriska neurotransmittorn, binder och aktiverar ytan-uttryckte GluRs att kontrollera grundläggande fysiologiska neuronala funktioner såsom synaptisk neurotransmission och synaptisk plasticitet. Det faktum att förändrad GluR-handel har observerats i ett brett spektrum av neuropatier, alltifrån neurologiska utvecklingsstörningar till neurodegenerativa sjukdomar, belyser vikten av denna process5. Att förstå de molekylära händelser som styr GluR-trafficking är därför av intresse för många forskningsområden.
I detta protokoll, en antikropp-utfodring baserad metod används för att kvantifiera nivån på ytan-uttryckta GluRs i primära Hippocampus nervceller samt utvärdera hur förändringar i internalisering och återvinning resultera i den observerade net ytan uttryck. Användning av farmakologi och/eller överuttryck av exogena receptorer härma specifika mutationer gör detta protokoll en särskilt kraftfull metod för att studera molekylära mekanismer bakom neuronala anpassning till olika miljömässiga stimuli. Ett sista exempel på nyttan med detta protokoll är att studera hur multifaktoriella förändringar i miljön (t. ex. i en sjukdoms modell) påverkar GluR-handeln genom undersökning av ytuttryck i sådana modeller.
Med hjälp av specifika exempel, det är initialt visat hur en farmakologisk manipulation imitera fysiologiska synaptisk stimulering [kemisk ltp (cltp)] ökar ytan uttrycket av endogena GluA1 subenhet av AMPA-typ av glurs (ampars) 6. handeln med en överuttryckt Phospho-mimetic form av GluN2B subenhet av NMDA-typ av glurs (nmdars) analyseras också för att exemplifiera hur detta protokoll kan användas för att studera regleringen av Glur-handel med specifika posttranslationella Ändringar. Även om dessa specifika exempel används, detta protokoll kan lätt appliceras på andra GluRs och andra receptorer och proteiner som besitter antigen extracellulära domäner. I det fall att det inte finns några antikroppar tillgängliga för extracellulära domäner, överuttryck av extracellulära Epitope-märkta (t. ex., flagga-, MYC-, GFP-märkta, etc.) proteiner kan bistå i protein märkning.
Det nuvarande protokollet innehåller anvisningar för att kvantifiera specifik GluR subtypdensitet och människohandel med hjälp av specifika antikroppar. Detta protokoll kan utnyttjas för att studera 1) totalt GluR ytuttryck, 2) GluR Internalization, och 3) GluR återvinning. För att studera varje enskild process bör man börja med avsnitten 1 och 2 och fortsätta med antingen avsnitt 3, 4 eller 5. I samtliga fall, avsluta med avsnitten 6 och 8 (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Samspelet mellan en cell och dess omgivning (t. ex. kommunikation med andra celler, respons på olika stimuli, etc.), är starkt beroende av det korrekta uttrycket av receptorer på cellytan. Den snabba och finjusterade regleringen i ytan-uttryckt receptor innehåll möjliggör korrekt cellulära svar på en ständigt föränderlig miljö. I det särskilda fallet av nervceller, förändringar i antalet, lokalisering, och subenhet sammansättning synaptically uttryckt receptorer starkt påverkar synaptisk kommunikation, s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Northwestern Center för avancerad mikroskopi för användning av Nikon a1 konfokala Mikroskop och deras hjälp med att planera och analysera experimenten. Denna forskning stöddes av NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), och NIA (R00AG041225) och ett NARSAD Young Investigator Grant från hjärnan & beteende Research Foundation (#24133) (A. S.-C.).
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
- Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
- Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
- Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
- Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
- Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).
