Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı
Summary
Bu makalede, ayrılmış primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptörü (GluR) kaçakçılığı çalışması için bir yöntem sunulur. Endojen veya aşırı ifade reseptörlerinin farmakolojik yaklaşımlar ile birlikte etiketlenmesi için antikor beslemeli bir yaklaşım kullanarak, bu yöntem, GluR yüzey ifadesini düzenleyen moleküler mekanizmaların belirlenmesi için izin verir veya geri dönüşüm süreçleri.
Abstract
Harici uyaranlara hücresel tepkiler ağır belirli bir anda hücre yüzeyinde ifade reseptörleri kümesine güveniyor. Buna göre, yüzey tarafından ifade edilen reseptörlerin nüfusu sürekli uyarlama ve sıkı düzenleme mekanizmalarına tabidir. Paradigma örneği ve biyolojideki en çok araştırılan kaçakçılık olaylarından biri de glutamat reseptörlerinin (GluRs) sinaptik ifadesinin denetlendiği kontrolidir. GluRs, sinaptik ve nöronal düzeylerde (örneğin, sinaptik plastisite), merkezi sinir sisteminde uyarıcı nörotransmisyon büyük çoğunluğu arabulucu ve fizyolojik aktivite bağımlı fonksiyonel ve yapısal değişiklikler kontrol. Yüzeydeki sayı, konum ve alt birim bileşiminde yapılan değişiklikler, GluRs ‘un nöronal fonksiyonları derinden etkilediğini ve aslında bu faktörlerde yapılan değişiklikler farklı nöropati ile ilişkilidir. Burada sunulan, disanated hipokampal primer nöronlar GluR ticareti incelemek için bir yöntemdir. “Antikor-besleme” yaklaşımı, yüzey ve iç membranlarda ifade edilen GluR nüfusunun farklılaşarak görselleştirilmesi için kullanılır. Yüzey reseptörlerini canlı hücrelerde etiketleme ve reseptörlere endositoz ve/veya geri dönüşüm için izin vermek için farklı zamanlarda sabitleme, bu kaçakçılık süreçleri değerlendirilebilir ve seçici olarak incelenebilir. Bu, GluR kaçakçılığı etkileyen uyarıcı ve moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler elde etmek için değiştirilmiş reseptörlerin farmakolojik yaklaşımlar veya aşırı ifade edilmesi ile birlikte kullanılabilecek çok yönlü bir protokoldür. Benzer şekilde, diğer reseptörleri veya yüzey ifade proteinleri çalışmak için kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Hücreler, proteinleri belirli alt hücresel lokalize olarak seferber etmek ve fonksiyonları1üzerinde sıkı bir mekan düzenlemesi yapmak için aktif ticaretini kullanır. Bu süreç özellikle transmembran reseptörleri için önemlidir, farklı çevresel uyaranlara hücresel tepkiler reseptör aktivasyonu ile tetiklenen hücre içi Cascades güveniyor gibi. Hücreler reseptör hücre altı ticareti düzenleme2ile hücre yüzeyinde ifade edilen reseptörlerin yoğunluğu, lokalizasyonu ve alt birim bileşimi değiştirerek bu yanıtları değiştirebilir. Yeni sentezlenmiş reseptörlerin plazma membranı içine yerleştirilmesi, endositoz ve mevcut reseptörlerin geri dönüşümünün yanı sıra yüzey-ifade reseptörlerinin net havuzunu belirleyen kaçakçılık süreçlerine örnektir2. Protein kaçakçılığı düzenleyen birçok Moleküler mekanizma işbirliği, proteinli protein etkileşimleri ve fosforilasyon, ubiquitination gibi posttranslasyonel modifikasyonlar, veya palmitoyasyon2.
Reseptör kaçakçılığının düzenlenmesi özellikle çok özel yapılarla güçlü polarize hücrelerde gereklidir. Paradigmatik örnek glutamat reseptörleri (glurs)3,4düzenlenmiş ticareti ile nöronal fonksiyon kontrolü. Glutamat, ana uyarıcı nörotransmitter, bağlar ve yüzey-ifade GluRs sinaptik nörotransmisyon ve sinaptik plastisite gibi temel fizyolojik nöronal fonksiyonları kontrol etmek için etkinleştirir. Nöro-gelişimsel bozukluklardan nörodejeneratif hastalıklara kadar uzanan geniş bir nöropati yelpazesinde GluR kaçakçılığı değiştirildiği gerçeğini bu sürecin5‘ in önemini vurgulamaktadır. Böylece, GluR kaçakçılığı kontrol eden moleküler olayların anlaşılması araştırma birçok alanda ilgi olduğunu.
Bu protokolde, primer hipokampal nöronların yüzey seviyesinin ölçülmesi için antikor beslemeli bir yöntem kullanılır, aynı zamanda ınterpralization ve geri dönüşümdeki değişikliklerin gözlenen net yüzey ifadesinde nasıl sonuçlanduğunu değerlendirebilirsiniz. Spesifik mutasyonları kullanan eksojen reseptörlerin farmakolojisinin ve/veya aşırı ifadesinin kullanımı, bu protokol, farklı çevresel uyaranlara nöronal adaptasyon temelindeki moleküler mekanizmaları incelemek için özellikle güçlü bir yaklaşım sağlar. Bu protokolün son örneği, ortamda (örneğin, bir hastalık modelinde), bu tür modellerde yüzey ifadesinin incelenmesi yoluyla GluR kaçakçılığı etkilemesi konusunda ne kadar multifokal değişiklikler yapılacağını okuyor.
Belirli örnekler kullanarak, başlangıçta fizyolojik sinaptik stimülasyon taklit bir farmakolojik manipülasyon nasıl gösterilmiştir [kimyasal LTP (cltp)] AMPA-glurs tipi (ampars) endojen GluA1 altbirim yüzey ifadesi artar 6. NMDA-türü glurs (nmdars) GluN2B altbirim bir aşırı ifade fosho-mimetic formu ticareti de bu protokol belirli posttranslasyonel tarafından Glur kaçakçılığı düzenlenmesi çalışmak için nasıl kullanılabilirler örnek olarak analiz edilir Değişiklik. Bu özel örnekler kullanılsa da, bu protokol diğer GluRs ve diğer reseptörlere ve antijenik hücre dışı alanlara sahip olan proteinler için kolayca uygulanabilir. Hücre dışı alanlar için mevcut antikorlar olmadığı durumda, ekstrelüler epitope etiketli (örn., bayrak-, MYC-, GFP-Tagged, vb.) proteinleri protein etiketlemeye yardımcı olabilir.
Geçerli protokol, spesifik antikorlar kullanarak belirli GluR alt tipi yoğunluğunu ve kaçakçılığı ölçmek için yönergeler sağlar. Bu protokol 1) Toplam GluR yüzey ifadesi, 2) GluR etilleştirme ve 3) GluR geri dönüşümü için kullanılabilir. Her bir işlemi bireysel olarak incelemek için 1 ve 2 bölümlerle başlamak ve 3, 4 veya 5 bölümüne devam etmeniz önerilir. Her durumda, 6 ve 8 bölümlerle bitir (Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir hücre ile çevre arasındaki etkileşim (örn. diğer hücrelerle iletişim, farklı uyaranlara yanıt vb.), hücre yüzeyinde reseptörlerin doğru ifadesine ağır dayanır. Yüzeydeki hızlı ve ince ayarlı düzenleme reseptör içeriği sürekli değişen bir ortama uygun hücresel yanıt sağlar. Nöronlar belirli durumda, sayı, yerelleştirme ve synaptically ifade reseptörlerinin alt bileşiminde değişiklikler ağır sinaptik iletişim etkiler, sinaptik plastisite, synaptogenit, ve sinaptik budama<sup cla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nikon a1 Confocal mikroskop ve deneyler planlama ve analiz yardım onların kullanımı için Northwestern gelişmiş Microkopi merkezi teşekkür ederiz. Bu araştırma (T32GM008061) (A. M. C), ve NIA (R00AG041225) ve Brain & davranış Araştırma Vakfı (#24133) (A. S.-C.) bir NARSAD genç araştırmacı Grant tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
- Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
- Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
- Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
- Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
- Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).
