Tau er et neuronal protein til stede både i cytoplasmaet, hvor det binder mikrotubuler, og i kernen, hvor det udøver ukonventionelle funktioner, herunder graduering af Alzheimers sygdom-relaterede gener. Her beskriver vi en metode til at undersøge funktionen af nukleare Tau, mens udelukke eventuelle interferenser, der kommer fra cytoplasmisk Tau.
Tau er en mikrotubulus bindende protein udtrykt i neuroner og dens vigtigste kendte funktion er relateret til vedligeholdelse af cytoskelet stabilitet. Nylige beviser indikerede imidlertid, at Tau også findes i andre subcellulære rum, herunder kernen, hvor det er impliceret i DNA-beskyttelse, i rRNA-transkriptionen, i mobiliteten af retrotransponer og i den strukturelle organisering af nucleolus. Vi har for nylig vist, at nuklear Tau er involveret i udtrykket af VGluT1 genet, hvilket tyder på en molekyl mekanisme, der kan forklare den patologiske stigning i glutamat frigivelse i de tidlige stadier af Alzheimers sygdom. Indtil for nylig har inddragelsen af nukleare Tau i modulering af ekspression af målgener været relativt usikker og tvetydig på grund af tekniske begrænsninger, der forhindrede udelukkelse af bidraget fra cytoplasmatiske Tau eller virkningen af andre downstream-faktorer, der ikke er relateret til nuklear Tau. For at overvinde denne usikkerhed, udviklede vi en metode til at studere ekspression af målgener specifikt moduleret af Nuclear Tau protein. Vi anvendte en protokol, der par brugen af lokaliserings signaler og subcellulære fraktionering, tillader udelukkelse af interferens fra cytoplasmatiske Tau molekyler. Mest bemærkelsesværdigt, at protokollen er let og er sammensat af klassiske og pålidelige metoder, der er stort set gælder for at studere den nukleare funktion af Tau i andre celletyper og cellulære betingelser.
Funktionerne af Tau protein i kernen har høstet betydelig interesse i de seneste år, da det har vist sig at være tæt forbundet med nukleinsyre syrer1,2,3,4,5,6. Faktisk viste en nylig genomdækkende undersøgelse, at Tau binder gene og intergene DNA-sekvenser in vivo7. En rolle i nucleolar organisation er blevet foreslået8,9,10,11. Desuden er Tau blevet foreslået at være involveret i DNA-beskyttelse fra oxidativ og melfalan stress5,10,12,13, hvorimod muterede Tau har været forbundet med kromosom ustabilitet og aneuploidi14,15,16.
Indtil nu, de udfordringer i at studere funktionerne i Tau i det nukleare rum forblev næsten uløste på grund af vanskeligheder med at dissekerer det specifikke bidrag af nukleare Tau fra bidraget fra cytoplasmatiske Tau. Desuden er de funktioner, der tilskrives Tau-molekyler i det nukleare rum indtil nu, kun korrelative, fordi de mangler en utvetydig demonstration af den direkte involvering af nukleare Tau-proteiner. Ja, inddragelsen af Tau i mobiliteten af retrotransposons eller i rRNA transskription eller i DNA-beskyttelse11,12,17,18,19 kan også forklares ved bidrag af cytoplasmatiske Tau eller af virkningen af andre downstream faktorer, der ikke er relateret til nukleare Tau.
Her giver vi en metode, der kan løse dette problem ved at udnytte en klassisk procedure for at isolere det nukleare rum kombineret med brugen af Tau konstruktioner 0N4R mærket med nuklear lokalisering (NLS) eller nukleare eksport signaler (NES). Denne tilgang eliminerer de komplekse problemer i forbindelse med mulige artefakter på grund af den afsmittende af Tau molekyler fra cytoplasmisk rum. Desuden inducerer Tau-NLS og Tau-NES konstruktioner tilsætning eller udelukkelse af Tau-molekyler fra det nukleare rum, hvilket giver positive og negative kontroller for involvering af nukleare Tau-molekyler i en bestemt funktion. Protokollen er teknisk let og er sammensat af klassiske og pålidelige metoder, der generelt gælder for at studere den nukleare funktion af Tau i andre celletyper, differentieret eller ej, såsom kræftceller, der genaktiverer Tau udtryk20,21. Desuden kan det også anvendes til andre proteiner, der er til stede i både cytoplasmaet og kernen for at dissekere biologiske funktioner i forbindelse med forskellige rum.
Vi beskriver en metode til at måle virkningen af nukleare Tau protein på genekspression. Med denne protokol er bidraget fra cytoplasmatiske Tau stærkt begrænset. Kritiske trin i denne protokol er følgende: differentieringen af humane neuroblastom SH-SY5Y celler, subcellulære fraktionering og lokalisering af Tau protein i det nukleare rum.
For det første, som det fremgår af afsnittet om repræsentative resultater, er differentieringen af SH-SY5Y celler ved at tilføje RA og BDNF afgøre…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Scuola normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |