Modulation de la localisation sous-cellulaire de Tau comme outil pour étudier l'expression des gènes liés à la maladie

Summary

Tau est une protéine neuronale présente à la fois dans le cytoplasme, où il lie les microtubules, et dans le noyau, où il exerce des fonctions non conventionnelles, y compris la modulation des gènes liés à la maladie d'Alzheimer. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier la fonction du Tau nucléaire tout en excluant toutes les interférences provenant du Tau cytoplasmique.

Abstract

Tau est une protéine de liaison microtubule exprimée dans les neurones et sa fonction principale connue est liée au maintien de la stabilité cytosquelettique. Cependant, des preuves récentes ont indiqué que Tau est également présent dans d'autres compartiments subcellulaires, y compris le noyau où il est impliqué dans la protection de l'ADN, dans la transcription de l'ARNr, dans la mobilité des rétrotransposons et dans l'organisation structurelle de la Nucléole. Nous avons récemment démontré que le Tau nucléaire est impliqué dans l'expression du gène VGluT1, suggérant un mécanisme moléculaire qui pourrait expliquer l'augmentation pathologique de la libération de glutamate dans les premiers stades de la maladie d'Alzheimer. Jusqu'à récemment, l'implication du nucléaire Tau dans la modulation de l'expression des gènes cibles était relativement incertaine et équivoque en raison de limitations techniques qui empêchaient l'exclusion de la contribution du Tau cytoplasmique ou l'effet d'autres facteurs en aval non liés au Tau nucléaire. Pour surmonter cette incertitude, nous avons mis au point une méthode pour étudier l'expression des gènes cibles spécifiquement modulées par la protéine tau nucléaire. Nous avons utilisé un protocole qui couple l'utilisation de signaux de localisation et la fractionnement subcellulaire, permettant l'exclusion de l'interférence des molécules cytoplasmiques Tau. Plus particulièrement, le protocole est facile et est composé de méthodes classiques et fiables qui sont largement applicables pour étudier la fonction nucléaire de Tau dans d'autres types de cellules et les conditions cellulaires.

Introduction

Les fonctions de la protéine Tau dans le noyau ont suscité un intérêt significatif ces dernières années, car il a été montré pour être étroitement associé aux acides nucléiques^1,2,3,4,5,6. En effet, une étude récente à l'échelle du génome a démontré que Tau lie des séquences d'ADN géniques et intergéniques in vivo⁷. Un rôle dans l'organisation nucléolar a été suggéré^8,9,

Protocol

1. Culture cellulaire

1. Culture SH-SY5Y cells (human neuroblastoma cell line, CRL-2266) in complete medium (Dulbecco's modified Eagle medium:nutrient mixture F12 [DMEM/F-12] complété par 10% de sérum bovin fœtal [FBS], 2 mM L-glutamine, 100 U/mL pénicilline et 100 'g/mLstreptomy). Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO_2. Cultivez les cellules dans des plaques de 10 cm et divisez-les lorsque le confluent.

2. Différenciation cellulaire

1. Pour différencier les cellules SH-SY5Y, le lendemain du placage, ajouter 10 millions d'acide rétinoïque (RA) pour compléter le milieu pendant 5 jours.<....

Results

La stratégie utilisée pour disséquer l'impact du Tau nucléaire dans l'expression des gènes en évitant la contribution des protéines tau cytoplasmiques a été décrite dans la figure 1. En bref, les protéines Tau étiquetées avec NLS ou NES sont accumulées ou exclues du compartiment nucléaire, respectivement. L'effet fonctionnel de ce déséquilibre est l'altération de l'expression génique mesurée comme le produit du gène VGluT1.

Discussion

Nous décrivons une méthode pour mesurer l'impact de la protéine Tau nucléaire sur l'expression de gène. Avec ce protocole, la contribution du tau cytoplasmique est fortement limitée. Les étapes critiques de ce protocole sont les suivantes : la différenciation des cellules sH-SY5Y du neuroblastome humain, la fractionnement subcellulaire et la localisation de la protéine Tau dans le compartiment nucléaire.

Tout d'abord, comme le montre la section des résultats représentatifs, la différenciation .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 633 chèvre anti-souris IgG	Life Technologies	A21050	IF 1:500
anti Actine	Anticorps BETHYL LABORATORIE	A300-485A	anti-lapin WB 1:10 000
anti GAPDH Anticorps	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	anti-souris WB 1:10 000
anti H2B Anticorps	Abcam	ab1790	anti-lapin WB 1:15 000
anticorps anti-Tau-13	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	anti-souris WB 1:1 000 ; IF 1:500
anti tubuline alpha	Anticorps Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	anti-souris WB 1:5 000
anti VGluT1 Anticorps	Sigma-Aldrich	AMAb91041	anti-souris WB 1:500
BCA Protein Assay Kit	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
Blotting-Grade Blocker	Biorad	1706404	Lait écrémé en poudre
BOVIN SÉRUM ALBUMINE	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	inhibiteur de protéase
Critère TGX 4-20 % Sans tache, 10 puits	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
Dulbecco’s Modified Eagle's Medium Low Glucose	Euroclone	ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8, 0,5 M
Sérum fœtal bovin	Euroclone	EC50182L
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
Chèvre anti-souris IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	WB 1:1 000
Chèvre anti-lapin IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1:1 000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	Octylphénoxy poly(éthylèneoxy)éthanol
Immobilon Western	MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech Lame de chambre 8 puits lame en verre	nunc	177402
L-glutamine	Euroclone	ECB3000D	100X
Lipofectamine 2000 réactif de transfection	Thermo Fisher Scientific	12566014	lipide cationique
Méthanol	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM sérum réduit moyen	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
Pénicilline/Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL, 100 mL
Saline tamponnée au phosphate (Dulbecco A)	OXOID	BR0014G
PhosStop	Roche	4906837001	inhibiteur de la phosphatase
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163	Étape 3.10
Acide rétinoïque	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
Kit de fractionnement des protéines subcellulaires pour cellules cultivées	Thermo Fisher Scientific	78840
Membrane nitrocellulosique supportée	Biorad	1620097
TC-Plate 6well	SARSTEDT	833,920
TCS SP2 microscope confocal à balayage laser	Leica	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Tensioactif non ionique
Trypsine-EDTA	Thermo Fisher Scientific	15400054	0.50 %
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD antifade support de montage	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV Minipreps Systèmes de purification	d’ADNPromega	A1330	Étape 3.5