Graduering af Tau subcellulære lokalisering som et redskab til at undersøge ekspression af sygdomsrelaterede gener

Summary

Tau er et neuronal protein til stede både i cytoplasmaet, hvor det binder mikrotubuler, og i kernen, hvor det udøver ukonventionelle funktioner, herunder graduering af Alzheimers sygdom-relaterede gener. Her beskriver vi en metode til at undersøge funktionen af nukleare Tau, mens udelukke eventuelle interferenser, der kommer fra cytoplasmisk Tau.

Abstract

Tau er en mikrotubulus bindende protein udtrykt i neuroner og dens vigtigste kendte funktion er relateret til vedligeholdelse af cytoskelet stabilitet. Nylige beviser indikerede imidlertid, at Tau også findes i andre subcellulære rum, herunder kernen, hvor det er impliceret i DNA-beskyttelse, i rRNA-transkriptionen, i mobiliteten af retrotransponer og i den strukturelle organisering af nucleolus. Vi har for nylig vist, at nuklear Tau er involveret i udtrykket af VGluT1 genet, hvilket tyder på en molekyl mekanisme, der kan forklare den patologiske stigning i glutamat frigivelse i de tidlige stadier af Alzheimers sygdom. Indtil for nylig har inddragelsen af nukleare Tau i modulering af ekspression af målgener været relativt usikker og tvetydig på grund af tekniske begrænsninger, der forhindrede udelukkelse af bidraget fra cytoplasmatiske Tau eller virkningen af andre downstream-faktorer, der ikke er relateret til nuklear Tau. For at overvinde denne usikkerhed, udviklede vi en metode til at studere ekspression af målgener specifikt moduleret af Nuclear Tau protein. Vi anvendte en protokol, der par brugen af lokaliserings signaler og subcellulære fraktionering, tillader udelukkelse af interferens fra cytoplasmatiske Tau molekyler. Mest bemærkelsesværdigt, at protokollen er let og er sammensat af klassiske og pålidelige metoder, der er stort set gælder for at studere den nukleare funktion af Tau i andre celletyper og cellulære betingelser.

Introduction

Funktionerne af Tau protein i kernen har høstet betydelig interesse i de seneste år, da det har vist sig at være tæt forbundet med nukleinsyre syrer^1,2,3,4,5,6. Faktisk viste en nylig genomdækkende undersøgelse, at Tau binder gene og intergene DNA-sekvenser in vivo⁷. En rolle i nucleolar organisation er blevet foreslået^8,9,10,11. Desuden er Tau blevet foreslået at være involveret i DNA-beskyttelse fra oxidativ og melfalan stress^5,10,12,13, hvorimod muterede Tau har været forbundet med kromosom ustabilitet og aneuploidi^14,15,16.

Indtil nu, de udfordringer i at studere funktionerne i Tau i det nukleare rum forblev næsten uløste på grund af vanskeligheder med at dissekerer det specifikke bidrag af nukleare Tau fra bidraget fra cytoplasmatiske Tau. Desuden er de funktioner, der tilskrives Tau-molekyler i det nukleare rum indtil nu, kun korrelative, fordi de mangler en utvetydig demonstration af den direkte involvering af nukleare Tau-proteiner. Ja, inddragelsen af Tau i mobiliteten af retrotransposons eller i rRNA transskription eller i DNA-beskyttelse^{11,12,17,18,19} kan også forklares ved bidrag af cytoplasmatiske Tau eller af virkningen af andre downstream faktorer, der ikke er relateret til nukleare Tau.

Her giver vi en metode, der kan løse dette problem ved at udnytte en klassisk procedure for at isolere det nukleare rum kombineret med brugen af Tau konstruktioner 0N4R mærket med nuklear lokalisering (NLS) eller nukleare eksport signaler (NES). Denne tilgang eliminerer de komplekse problemer i forbindelse med mulige artefakter på grund af den afsmittende af Tau molekyler fra cytoplasmisk rum. Desuden inducerer Tau-NLS og Tau-NES konstruktioner tilsætning eller udelukkelse af Tau-molekyler fra det nukleare rum, hvilket giver positive og negative kontroller for involvering af nukleare Tau-molekyler i en bestemt funktion. Protokollen er teknisk let og er sammensat af klassiske og pålidelige metoder, der generelt gælder for at studere den nukleare funktion af Tau i andre celletyper, differentieret eller ej, såsom kræftceller, der genaktiverer Tau udtryk^20,21. Desuden kan det også anvendes til andre proteiner, der er til stede i både cytoplasmaet og kernen for at dissekere biologiske funktioner i forbindelse med forskellige rum.

Protocol

1. cellekultur Kultur SH-SY5Y celler (Human neuroblastom cellelinje, CRL-2266) i komplet medium (Dulbecco’s modificerede Eagle medium: næringsstof blanding F12 [DMEM/F-12] suppleret med 10% føtal kvægserum [FBS], 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin). Opretholde cellerne i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2. Vokse celler i 10 cm plader og split, når confluent. 2. Celledifferentiering For at skelne SH-SY5Y celler, dagen efter pl…

Representative Results

Den strategi, der anvendes til at dissekere virkningen af nukleare Tau i genekspression undgå bidrag af cytoplasmatiske Tau proteiner er blevet afbildet i figur 1. Kort sagt akkumuleres Tau-proteiner, der er mærket med NLS eller NES, henholdsvis i eller udelukket fra det nukleare rum. Den funktionelle virkning af denne ubalance er ændringen af genekspression målt som produktet af VGluT1 genet. E…

Discussion

Vi beskriver en metode til at måle virkningen af nukleare Tau protein på genekspression. Med denne protokol er bidraget fra cytoplasmatiske Tau stærkt begrænset. Kritiske trin i denne protokol er følgende: differentieringen af humane neuroblastom SH-SY5Y celler, subcellulære fraktionering og lokalisering af Tau protein i det nukleare rum.

For det første, som det fremgår af afsnittet om repræsentative resultater, er differentieringen af SH-SY5Y celler ved at tilføje RA og BDNF afgøre…

Materials

Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A21050	IF 1:500
anti Actin Antibody	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	anti-rabbit WB 1:10000
anti GAPDH Antibody	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	anti-mouse WB 1:10000
anti H2B Antibody	Abcam	ab1790	anti-rabbit WB 1:15000
anti Tau-13 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody	Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	anti-mouse WB 1:5000
anti VGluT1 Antibody	Sigma-Aldrich	AMAb91041	anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
Blotting-Grade Blocker	Biorad	1706404	Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose	Euroclone	ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH=8 0.5M
Foetal Bovine Serum	Euroclone	EC50182L
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	WB 1:1000
Goat anti-rabbit IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1:1000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western	MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide	nunc	177402
L-glutamine	Euroclone	ECB3000D	100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher Scientific	12566014	cationic lipid
Methanol	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/ml, 100ml
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	OXOID	BR0014G
PhosStop	Roche	4906837001	phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163	Step 3.10
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells	Thermo Fisher Scientific	78840
Supported Nitrocellulose membrane	Biorad	1620097
TC-Plate 6well	SARSTEDT	833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope	Leica	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	15400054	0.50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems	Promega	A1330	Step 3.5