細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ
Summary
機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。
Abstract
デュロタキシスは、細胞が緊張の勾配を感知し、応答するプロセスです。このプロセスをインビトロで研究するためには、細胞の下にある基板の剛性を操作する必要があります。等級付き剛性と長期移行アッセイを有するヒドロゲルは、デュロタキシス研究に有用であることが証明されているが、基板張力の局所的変化に対する即時かつ急性応答は、個々の細胞運動および細胞内シグナル伝達事象の集中的な研究を可能にする。細胞が基礎となる基板剛性を感知し応答する能力を繰り返しテストするために、変形可能なヒドロゲル上で培養された個々の細胞に対する高い張力の急性勾配を適用するための改変方法が使用され、リアルタイムを可能にする。問題の細胞に付与された剛性勾配の強さと方向の操作。さらに、マイクロピペットの形状や寸法、適用された勾配の相対的な位置、配置、方向など、アッセイの詳細とパラメータを微調整することにより、アッセイを機械的に任意の研究に最適化することができます。敏感な細胞のタイプおよびシステム。これらのパラメータは、適用された刺激を確実に変更し、アッセイの機能性および汎用性を拡張するように変更することができる。この方法は、剛性の変化に応じて、長期的なデュロタクティック運動だけでなく、細胞シグナル伝達と形態学的ダイナミクスのより即時の変化の両方を調べることができる。
Introduction
過去数十年にわたり、細胞環境の機械的特性の重要性は、細胞生物学における認知度を高めています。異なる組織と細胞外マトリックスは、異なる相対的な剛性を有し、細胞が体全体に移動するにつれて、これらの変化をナビゲートし、これらの機械的特性を使用して1、2、3を導く,4,5,6,7.細胞は、発達、創傷治癒、癌転移などのプロセス中に、所定の組織の剛性を使用して、その動態を知らせます。しかし、これらの機械的入力に対する感覚および応答を可能にする分子機構は、ほとんど未知のままである1,2,3,4,5,6,7.
細胞が物理的な環境的手がかりに反応するメカニズムを研究するためには、付着細胞の下にある基板の剛性または剛性を操作する必要があります。2000年、Chun-Min Lo、Yu-Li Wangたちは、機械的手掛かりを変化させる個々の細胞の動体応答を、変形可能な細胞外マトリックス(ECM)コーティングされたポリアクリルアミドを伸ばすことによって直接試験することができるアッセイ8を開発した。細胞がめっきされたヒドロゲル。細胞は、より硬い基板に向かって移動するための重要な好みを示す, 彼らは「デュロタキシス」と呼ばれる現象.
2000年の最初の報告以来、デュロタキシスの研究のために他の多くの技術が採用されています。急な剛性勾配は、ポリスチレンビーズ9や剛性ポリマーポスト10などの剛性特徴にゲルを鋳造するか、ガラスカバースリップ11の縁の周りの基板を重合することによって、機械的な’を作成することによって製造されています。ステップ境界’。あるいは、浅いが固定剛性勾配を持つヒドロゲルは、マイクロ流体デバイス12、13または並んでヒドロゲル溶液液滴によって作成された架架カーの勾配などの様々な方法によって製造されている異なる剛性8、または線形剛性勾配14、15を作成するために等級付きUV光露光で処理された光反応性架リンカーを有するヒドロゲル。これらの技術は、時間の経過とともに一斉に二次的に起因するデュロタクティック細胞運動を調査するために大きな効果を使用されてきた。しかし、通常、これらの特徴は細胞めっきの前に製造され、その特性は実験の過程で一貫したままであり、機械的勾配のサンプリングのためにランダムな細胞運動に依存します。これらの技術のいずれも、急性機械的刺激に応答して細胞行動の急速な変化を観察することは好適ではない。
機械的環境の急激な変化に対する細胞応答を観察するために、単細胞デュロタシスアッセイはいくつかの利点を提供する。これらのアッセイでは、個々の細胞は、ガラスマイクロピペットで細胞から基底基板を引き離すことによって急性の機械的刺激を与えられ、それによって細胞マトリックス張力の方向勾配を導入する。その後、移動の速度や方向などの動きの変化は、生細胞位相コントラスト顕微鏡によって観察されます。このアプローチは、機械的刺激と細胞移動との間の原因と効果の関係を直接観察することを容易にし、緊張勾配の方向と大きさの迅速かつ反復的な操作を可能にし、結果的に評価するリアルタイムで細胞応答。また、この方法は、蛍光融合タンパク質またはバイオセンサを発現する細胞を機械的に刺激し、機械化に関与していると疑われるタンパク質の量、活性、または細胞内局在の変化を可視化するためにも用いることができる。デュロタキシス。
この技術は、デュロタシス8、16を研究するグループによって採用されており、SKOV-3卵巣癌細胞の不作法挙動および分子機構を研究するためにハウ研究所によって適応されたとして、ここで説明されています。下デュロタシス17.さらに、細胞培養表面の近くに蛍光微小球の単一の層を有するヒドロゲルの製造のための修飾方法が記載されている。これはマイクロピペットによって発生した株の勾配の視覚化および最適化を促進し、牽引力顕微鏡による細胞収縮性の評価を可能にするかもしれない。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで実証されているのは、急性機械的手がかりに応じて細胞の移動挙動を変化させる能力の評価を可能にする、反復可能な単細胞デュロタシスアッセイです。この技術はまた、蛍光顕微鏡および適切な融合タンパク質またはバイオセンサと組み合わせて、機械的刺激の数秒以内に、またはより長いタイムスケールの間に細胞内シグナル伝達および細胞骨格イベントを調べるために使用する?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
なし。
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
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