Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse
Summary
Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.
Abstract
Durotaxis ist der Prozess, durch den Zellen Spannungsverspannungen erkennen und darauf reagieren. Um diesen Prozess in vitro zu untersuchen, muss die Steifigkeit des einer Zelle zugrunde liegenden Substrats manipuliert werden. Während sich Hydrogele mit abgestufter Steifigkeit und Langzeit-Migrationstests in Durotaxis-Studien als nützlich erwiesen haben, ermöglichen sofortige, akute Reaktionen auf lokale Veränderungen der Substratspannung eine gezielte Untersuchung einzelner Zellbewegungen und subzellulärer Signalereignisse. Um die Fähigkeit der Zellen, die zugrunde liegende Substratsteifigkeit zu erkennen und darauf zu reagieren, zu testen, wird eine modifizierte Methode zur Anwendung akuter Verspannungen erhöhter Spannung auf einzelne Zellen verwendet, die auf verformbaren Hydrogelen kultiviert werden und echtzeitfähig sind. Manipulation der Festigkeit und Richtung der SteifigkeitGradienten, die den betreffenden Zellen vermittelt werden. Durch feinabstimmung der Details und Parameter des Assays, wie Form und Abmessungen der Mikropipette oder der relativen Position, Platzierung und Richtung des angewendeten Gradienten, kann der Assay für die Untersuchung jeder mechanisch empfindlichen Zelltyp und -system. Diese Parameter können geändert werden, um den angewendeten Stimulus zuverlässig zu verändern und die Funktionalität und Vielseitigkeit des Assays zu erweitern. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung sowohl der langfristigen durotaktischen Bewegung als auch unmittelbarerer Veränderungen der zellulären Signalisierung und morphologischen Dynamik als Reaktion auf sich ändernde Steifigkeit.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten hat die Bedeutung der mechanischen Eigenschaften der Umgebung einer Zelle in der Zellbiologie zunehmend Anerkenntnis gefunden. Verschiedene Gewebe und extrazelluläre Matrizen haben unterschiedliche relative Steifigkeiten und, wie Zellen im ganzen Körper wandern, navigieren sie diese Veränderungen, mit diesen mechanischen Eigenschaften, um sie zu führen1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. Zellen verwenden die Steifigkeit eines gegebenen Gewebes, um ihr motileverhalten während Vonprozessen wie Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung zu informieren. Die molekularen Mechanismen, die das Aufsehen und die Reaktion auf diese mechanischen Eingänge ermöglichen, bleiben jedoch weitgehend unbekannt1,2,3,4,5, 6 , 7.
Um die Mechanismen zu untersuchen, durch die Zellen auf physikalische Umwelthinweise reagieren, muss die Steifigkeit oder Steifigkeit des Substrats, das den anhaftenden Zellen zugrunde liegt, manipuliert werden. Im Jahr 2000 entwickelten Chun-Min Lo, Yu-Li Wang und Kollegen einen Assay 8, bei dem die motile Reaktion einer einzelnen Zelle auf wechselnde mechanische Hinweise direkt durch Dehnen verformbarer extrazellulärer Matrix (ECM)-beschichteter Polyacrylamid getestet werden konnte. Hydrogele, auf denen die Zellen plattiert wurden. Zellen weisen eine signifikante Präferenz für die Migration zu steiferen Substraten auf, ein Phänomen, das sie als “Durotaxis” bezeichneten.
Seit dem ursprünglichen Bericht im Jahr 2000 wurden viele andere Techniken für die Untersuchung von Durotaxis eingesetzt. Steile Steifigkeitsgradienten wurden hergestellt, indem Gele über starre Merkmale wie Polystyrolperlen9 oder steife Polymerpfosten10 gegossen wurden oder indem das Substrat um die Ränder eines Glasdeckels11 polymerisiert wurde, um mechanische ‘ Schrittgrenzen”. Alternativ wurden Hydrogele mit flacheren, aber festen Steifigkeitsgradienten durch eine Vielzahl von Methoden hergestellt, wie z. B. Gradienten von Vernetzern, die durch mikrofluidische Vorrichtungen12,13 oder nebeneinander gebaute Hydrogellösungströpfchen erzeugt werden. mit unterschiedlicher Steifigkeit8oder Hydrogele mit photoreaktivem Vernetzen, die mit abgestufter UV-Lichtbelichtung behandelt werden, um einen linearen Steifigkeitsgradienten14,15zu erzeugen. Diese Techniken wurden mit großer Wirkung verwendet, um durotaktische zelluläre Bewegung en masse im Laufe der Zeit zu untersuchen. In der Regel werden diese Features jedoch im Vorfeld der Zellbeschichtung hergestellt, und ihre Eigenschaften bleiben im Laufe des Experiments konsistent und stützen sich auf zufällige Zellbewegungen für die Probenahme mechanischer Gradienten. Keine dieser Techniken ist für die Beobachtung schneller Veränderungen des zellulären Verhaltens als Reaktion auf akute mechanische Reize geeignet.
Um zelluläre Reaktionen auf akute Veränderungen in der mechanischen Umgebung zu beobachten, bieten Einzelzelldurotaxis-Assays mehrere Vorteile. In diesen Assays erhalten einzelne Zellen einen akuten, mechanischen Stimulus, indem sie das darunter liegende Substrat mit einer Glasmikropipette aus der Zelle herausziehen und so einen Richtungsgradienten der Zellmatrixspannung einführen. Veränderungen des motilen Verhaltens, wie Geschwindigkeit oder Migrationsrichtung, werden dann durch die Live-Zell-Phasenkontrastmikroskopie beobachtet. Dieser Ansatz erleichtert die direkte Beobachtung von Ursache-Wirkungs-Beziehungen zwischen mechanischen Reizen und Zellmigration, da er eine schnelle, iterative Manipulation der Richtung und Größe des Spannungsgradienten und die Bewertung der daraus resultierenden zelluläre Reaktionen in Echtzeit. Darüber hinaus kann diese Methode auch verwendet werden, um Zellen, die fluoreszierende Fusionsproteine oder Biosensoren exezieren, mechanisch zu stimulieren, um Veränderungen in Menge, Aktivität oder subzellulärer Lokalisierung von Proteinen zu visualisieren, die im Verdacht stehen, an mechanosensing und durotaxis.
Diese Technik wurde von Gruppen eingesetzt, die Durotaxis8,16 studieren und wird hier beschrieben, da sie vom Howe Laboratory angepasst wurde, um das durotaktische Verhalten von SKOV-3 Eierstockkrebszellen und die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die unter ly durotaxis17. Zusätzlich wird ein modifiziertes Verfahren für die Herstellung von Hydrogelen mit einer einzigen, gleichmäßigen Schicht fluoreszierender Mikrosphären in der Nähe der Zellkulturoberfläche beschrieben; Dies erleichtert die Visualisierung und Optimierung von mikropipettegenerierten Dehnungsgradienten und kann die Beurteilung der Zellkontraktilität durch Traktionskraftmikroskopie ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird ein wiederholbarer, einzelliger Durotaxis-Assay gezeigt, der die Beurteilung der Fähigkeit einer Zelle ermöglicht, ihr Migrationsverhalten als Reaktion auf akute mechanische Hinweise zu ändern. Diese Technik kann auch in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie und geeigneten Fusionsproteinen oder Biosensoren eingesetzt werden, um subzelluläre Signalisierung und zytoskelettale Ereignisse innerhalb von Sekunden nach mechanischer Stimulation oder über einen längeren Zeitraum während der durotaktische Bewegun…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nichts.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Biologie du développement. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
