Одноклеточная durotaxis Анализ для оценки механического контроля клеточного движения и связанных с ними сигнальных событий
Summary
Механические силы имеют важное значение для контроля миграции ячеек. Этот протокол демонстрирует использование эластичных гидрогелей, которые могут быть деформированы с помощью стеклянного микропипетика и микроманипулятора, чтобы стимулировать клетки с локальным градиентом жесткости, чтобы вызвать изменения в структуре клеток и миграции.
Abstract
Дуротаксис – это процесс, с помощью которого клетки ощущают и реагируют на градиенты напряжения. Для того, чтобы изучить этот процесс in vitro, жесткость субстрата, лежащего в основе клетки, должна быть обработана. В то время как гидрогели с градуированной жесткостью и долгосрочными миграционными анализами оказались полезными в исследованиях durotaxis, немедленные, острые реакции на локальные изменения в напряжении субстрата позволяют целенаправленно изучать отдельные движения клеток и субклеточные сигнальные события. Для повторного тестирования способности клеток чувствовать и реагировать на тонус поддвижного субстрата используется модифицированный метод применения острых градиентов повышенного напряжения к отдельным клеткам, культивируемым на деформируемых гидрогелях, что позволяет в режиме реального времени манипуляции силы и направления жесткости градиентов, привитых на клетки в вопросе. Кроме того, путем тонкой настройки деталей и параметров исследования, таких как форма и размеры микропипетты или относительное положение, размещение и направление прикладного градиента, анализ может быть оптимизирован для изучения любого механически чувствительный тип клеток и система. Эти параметры могут быть изменены, чтобы надежно изменить прикладной стимул и расширить функциональность и универсальность асссе. Этот метод позволяет изучить как долгосрочные дуротаксические движения, а также более непосредственные изменения в клеточной сигнализации и морфологической динамики в ответ на изменение жесткости.
Introduction
За последние несколько десятилетий, важность механических свойств среды клетки получила все большее признание в клеточной биологии. Различные ткани и внеклеточные матрицы имеют различные относительные скованности и, как клетки мигрируют по всему телу, они перемещаются эти изменения, используя эти механические свойства, чтобы направлять их1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. Клетки используют жесткость данной ткани, чтобы сообщить их подвижное поведение во время процессов, таких как развитие, заживление ран, и метастазы рака. Тем не менее, молекулярные механизмы, которые позволяют ощущение и ответ на эти механические входы остаются в значительной степени неизвестны1,2,3,4,5, 6 , 7.
Для того, чтобы изучить механизмы, с помощью которых клетки реагируют на физические экологические сигналы, жесткость или жесткость подстилающих клеток адепта должны быть манипулированы. В 2000 году Чун-Мин Ло, Yu-Li Wang и его коллеги разработали асссс8, в соответствии с которым мотовый ответ отдельных клеток на изменение механических сигналов может быть непосредственно протестирован путем растяжения деформируемой внеклеточной матрицы (ECM) с покрытием полиакриламид гидрогели, на которых были покрыты клетки. Клетки демонстрируют значительное предпочтение для миграции в сторону более жестких субстратов, явление, которое они окрестили “durotaxis”.
После первоначального доклада в 2000 году для изучения дуротаксиса были использованы многие другие методы. Крутые градиенты жесткости были изготовлены путем литья гелей над жесткими функциями, такими как полистирол бусы9 или жесткие полимерные столбы10 или путем полимеризации субстрата по краям стеклянных крышки11 для создания механических ‘ шаг-границы. Кроме того, гидрогели с более мелкими, но фиксированными градиентами жесткости были изготовлены различными методами, такими как градиенты кросслинкера, созданные микрофлюидными устройствами12,13 или бок о бок каплями гидрогеля различной жесткости8, или гидрогелей с фотореактивным кросслинкером, обработанным с градуированным воздействием УФ-излучения для создания линейного градиента жесткости14,15. Эти методы были использованы для большого эффекта для исследования durotactic клеточного движения в массовом порядке с течением времени. Однако, как правило, эти функции изготавливаются до клеточного покрытия и их свойства остаются последовательными в течение эксперимента, полагаясь на случайное движение клеток для выборки механических градиентов. Ни один из этих методов поддаются наблюдению быстрых изменений в клеточном поведении в ответ на острый механический стимул.
Для того, чтобы наблюдать клеточной реакции на острые изменения в механической среде, одиночные анализы durotaxis ячейки предлагают несколько преимуществ. В этих анализах, отдельные клетки даны острый, механический стимул, потянув основной субстрат от клетки со стеклянной микропипеткой, тем самым вводя направленный градиент клеточной матрицы напряженности. Изменения в поведении подвижного, такие как скорость или направление миграции, затем наблюдаются с помощью контрастной микроскопии фазы живых клеток. Такой подход облегчает прямое наблюдение причинно-следственной связи между механическими стимулами и миграцией клеток, поскольку позволяет быстро, итеративное манипулирование направлением и величиной градиента напряжения и оценку последующего сотовых реакций в режиме реального времени. Кроме того, этот метод может также использоваться для механически стимулирующих клетки, выражающие флуоресцентные белки синтеза или биосенсоры, чтобы визуализировать изменения в количестве, активности или субклеточной локализации белков, подозреваемых в участии в механосенсировании и дюротаксис.
Этот метод был использован группами, которые изучают durotaxis8,16 и описывается здесь, как он был адаптирован лабораторией Хоу для изучения дуротаксического поведения sKOV-3 раковых клеток яичников и молекулярных механизмов, которые под дуротаксис17. Кроме того, описан модифицированный метод изготовления гидрогелей с одним, ровным слоем флуоресцентных микросфер вблизи поверхности клеточной культуры; это облегчает визуализацию и оптимизацию микропайпетов генерируемых градиентов деформации и может позволить оценку сотруднности клеток с помощью микроскопии силы тяги.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь демонстрируется повторяемый одноклеточный durotaxis тест, который позволяет оценить способность клетки изменять свое миграционное поведение в ответ на острые механические сигналы. Этот метод также может быть использован в сочетании с флуоресценционной микроскопией и соответствую…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ни один.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Biologie du développement. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
