توضح هذه المقالة طريقه لتوليد الوظيفية الورم مستضد الخاصة المستحثة مستحث الخلايا الجذعية المشتقةCD8αβ + أحاديه الخلية T ايجابيه باستخدام OP9/DLL1 نظام الثقافة المشتركة.
توليد وتوسيع الخلايا الوظيفية T في المختبر يمكن ان يؤدي إلى مجموعه واسعه من التطبيقات السريرية. أحد هذه الاستخدامات هو لعلاج المرضي الذين يعانون من سرطان متقدمة. وقد ثبت ان نقل الخلايا T بالتبني (ACT) من الخلايا العالية التخصيب مستضد الأورام الخاصة تسبب انحدار دائم من السرطان المنتشر في بعض المرضي. ومع ذلك ، خلال التوسع ، قد تصبح هذه الخلايا استنفدت أو السكون ، والحد من وظيفتها المستجيب والثبات في الجسم المجري. قد المستحثة مستحث الخلايا الجذعية (iPSC) التكنولوجيا التغلب علي هذه العقبات من خلال المؤدية إلى توليد في المختبر من اعداد كبيره من الخلايا T الأورام اقل تمايزا المحددة. IPSC الإنسان (hiPSC) لديها القدرة علي التفريق في اي نوع من الخلايا الجسدية ، بما في ذلك اللمفاويات ، والتي تحتفظ الاصليه مستقبلات الخلية T (TCR) أعاده ترتيب الجينوم عندما يتم استخدام خليه T كخليه البداية. لذلك ، أعاده برمجه الخلايا البشرية الخاصة مستضد الورم إلى hiPSC متبوعا بالتمايز إلى سلاله الخلية T لديه القدرة علي إنتاج خلايا T الأورام التي تجدد شبابها المحددة. وصفت هنا طريقه لتوليد الأورام مستضد محددهCD8αβ + واحده ايجابيه (SP) خلايا T من hipsc باستخدام OP9/DLL1 نظام الثقافة المشتركة. هذه الطريقة هي أداه قويه لتوليد سلاله الخلايا T في المختبر وسوف تسهل تطوير خلايا T المستمدة من المختبر لاستخدامها في الطب التجديدي والعلاجات القائمة علي الخلايا.
بالاضافه إلى المزايا الفسيولوجية ، الخلايا T لديها العديد من التطبيقات العلاجية المحتملة. ويمكن استخدام الجيل والتوسع في خلايا T في المختبر لنمذجة الامراض والتحقق من صحة العلاج ، فضلا عن مصدر لعلاج الدول الوراثية والمكتسبة من العوز المناعي (اي نقص المناعة الفيروسية والثانوية اللمفاوية العلاج الكيميائي أو زرع) والقضاء علي السرطان. وقد أدت هذه النوعية الاخيره إلى تطوير نقل الخلية T التبني (ACT) لعلاج المرضي الذين يعانون من سرطان متقدمة1.
ACT يتكون من أعاده إخراج الورم المريض ، واستخراج الخلايا الليمفاوية التسلل الورم (TILs) ، وتوسيع TILsالسابقينالجسم الخارجي ، ثم reinfusing الخلية الموسعة في المريض 2. وقد ثبت ان طريقه العلاج الفعال لبعض المرضي الذين يعانون من السرطان المنتشر. لسوء الحظ ، ليس كل المرضي يستجيبون لهذا العلاج. وقد أظهرت التقارير السابقة ان حاله التمايز من الخلايا المنقولة3،4،5،6،7،8،9، استخدام اعداد كبيره من الخلايا السرطانية العالية التخصيب الخاصة مستضد السرطان10، واستمرار الخلايا t بعد نقل11،12 كلها ترتبط مع ردود أكثر دواما13،14. ولذلك ، عندما يفشل ACT للحصول علي استجابه مضاده للورم ، فانه قد يكون جزئيا بسبب انخفاض الغلة من الخلايا السرطانية الخاصة مستضد السرطان ، والتوسع السابق غير فعاله التي تؤدي إلى استنفاد وفقدان الاستنساخ التفاعلية ، أو عدم الثبات بعد نقل4 . وقد افترض انه يمكن التغلب علي هذه العقبات من خلال توليد اعداد كبيره من خلايا T السرطانية الخاصة الأقل تمايزا في المختبر15,16.
الخلايا الجذعية/السلف التي تكون الدم (HSPCs) هي مصدر تقليدي لتوليد خلايا T في المختبر ، علي الرغم من ان هذه الطريقة محدوده بعدد صغير من الخلايا التي يمكن استعادتهامن متبرع واحد. كما تبين ان الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) تنتج خلايا T ولكن مع انخفاض الغلة17، مما يجعلها غير فعاله للتطبيقات السريرية. وعلاوة علي ذلك ، نظرا لان الخلايا السلالة T تجربه أعاده الدمج الجينية العشوائية من مستقبلات الخلية T (TCRs) في مراحل النمو في وقت مبكر ، فانه ليس من الممكن استخدام HSPCs أو ESCs لتوليد السكان النقي من خلايا T مستضد محدده دون مزيد من الجينوم التعديلات مثل محول الجينات TCR.
نهج واحد للتغلب علي هذه المحاذير هو أعاده برمجه TILs للخلايا الجذعية مستحث الإنسان المستحثة (hiPSCs) ، والتي قد توفر مصدرا لا حدود له في المختبر توليد الخلايا T. وقد تبين ان السرطان tils محدده مستضد يمكن أعاده برمجتها في hipscs والتفريق إلى السلالة t الخلية, الذي يحتفظ بنفس مستقبلات الخلية t (TCR) الجينات ترتيب كما الأصلي تي الخلية18,19. هذه التفاصيل مهمة بالنسبة للقانون لان أورام المريض الفردية لها ملامح فريدة من نوعها ، وقد ثبت ان عدد قليل جدا من مستضدات السرطان مشتركه بين المرضي20. ولذلك ، فان استخدام TILs الخاصة بالسرطان كمصدر للجيل المختبر من خلايا T المشتقة من hiPSC قد يوفر استراتيجية جديده للمعالجة الشخصية للمرضي المصابين بالسرطان المنتشر.
ويرد هنا بالتفصيل بروتوكول للتمييز بين خلايا السلالة T المشتقة من hiPSC في خلاياCD8αβ الوظيفية الخاصة بالمولدات المناعية الخاصة (SP) باستخدام OP9/DLL1. هذا الأسلوب هو أداه قويه في المختبر التمايز الخلية T من hiPSCs ، الأسلاف التي تكون الدم ، والخلايا الجذعية الجنينية ، فضلا عن تطبيقاتها الأخرى في الطب التجديدي والعلاجات القائمة علي الخلايا.
الثقافة المشتركة OP9 murine الخلايا اللحمية هو نظام راسخ لتوليد في المختبر من الخلايا الليمفاوية (اي ، ناغورني كاراباخ ، B ، وخليه T) من HSPCs والخلايا الجذعية مستحث. مطلوب الشق الإشارات للحث علي النسب t التزام ويمكن إنجازها من قبل التعبير عن الرحم من الشق يجند DLL1 أو DLL4 ، والتي لها فعاليه مماثله لتوليد الخلايا t1. ولذلك ، أصبح نظام الثقافة المشتركة OP9/DLL1 طريقه تستخدم علي نطاق واسع لإنتاج خلايا T في المختبر. وعلاوة علي ذلك ، ينطبق هذا الأسلوب للاستخدام مع عده أنواع ومصادر الخلايا البشرية ، بما في ذلك دم الحبل الشوكي ، ونخاع العظم HSPCs و ESCs. ومع ذلك ، فان توليد خلايا T من هذه المصادر محدود اما عن طريق الاسترجاع غير الكافي للخلايا المصدر أو عن طريق التمايز غير الفعال إلى الخلايا T1. بالاضافه إلى ذلك ، لا يمكن إنشاء منتج خليه T مع أعاده تجميع TCR واحد من مصادر المرجع المفتوحة هذه. باستخدام تقنيات الطب التجديدي ، اي المستحثة مستحث الخلايا الجذعية (iPSC) التكنولوجيا ، فانه قد يكون من الممكن لإنتاج اعداد هائله من خلايا T مستضد محدده للاستخدام في العلاجات القائمة علي الخلايا15.
hiPSCs تشبه مستحث ESCs في قدرتها علي التجديد الذاتي ، والتوسع لا حدود لها ، والقدرة علي التفريق إلى اي نوع من الخلايا الجسدية في الجسم. ومع ذلك ، فانها تفتقر إلى المخاوف الاخلاقيه المحيطة باستخدام المنتجات من أصل جنيني للتطبيقات السريرية. وعلاوة علي ذلك ، يمكن إنتاج hiPSCs من اي خليه جسديه ، مما يسمح بتطوير المنتجات الخلوية للطب الشخصي. في التقارير السابقة ، وقد تم إنتاج hipscs من خلايا t الإنسان باستخدام خلايا أحاديه النواة الطرفية كامله ،CD3 + الخلايا ، أو اللمفاويات المعزولة السامة للخلايا (ctls) كمصدر18،19،22، 26. عندما يتم إنشاء hipscs من مصدر خليه t (t-ipscs) ، يتم توريث أعاده ترتيب الجينات TCR الأصلي. ولذلك ، المريض T-iPSC الخلايا المشتقة T قد توفر نموذجا لعلاج شخصيه القانون من خلال استهداف مستضدات السرطان متميزة المريض.
وينقسم التفريق بين الخلايا الجذعية مستحث الإنسان إلى خلايا النسب T إلى خطوتين: جيل خلايا السلف التي تكون الدم (HPCs)27 والتمايز المزيد في الخلايا T النسب21. ويمكن إنجاز كلا الخطوتين باستخدام نظام الثقافة المشتركة OP9/DLL1. الأهم من ذلك ، فان نوعيه الخلايا المغذية OP9/DLL1 أمر بالغ الاهميه لنجاح التمايز الخلية T. وبما ان الخلايا OP9/DLL1 ليست خطا للخلايا المتجانسة الخلد ، فان نوعيه الأوضاع الخاصة بالنقابات والظروف الثقافية لها اهميه حاسمه في الحفاظ علي توسعها دون فقدان القدرة علي دعم تمايز hiPSC. ولذلك ، فمن المستحسن لتقييم ما قبل الكثير من الإجراءات المنفذة والمرور باستمرار عندما يبدا الاتصال سيتوبلازمي خليه إلى خليه تحدث ، من أجل منع تمايز الخلايا والشيخوخة. نقطه واحده لتاخذ في الاعتبار هو ان الاتصال من الخلية إلى الخلية يمكن ان تظهر لا يمكن تمييزها من الخلفية اعتمادا علي النقيض من المرحلة والتكبير من المجهر. في تجربتنا ، ومعظم الاطباق OP9/DLL1 وسوف يبدو ان 80 ٪ متموج عندما تكون جاهزه للمرور.
وقد تبين ان الخلايا السلالة t التي تم إنشاؤها من t-ipscs بواسطة OP9/DLL1 الثقافة المشتركة يمكن ان تنتجCD8 + SP t الخلايا علي التحفيز18,19. ومع ذلك, أعادهCD8 + SP T الخلايا الحصول علي الفطرية مثل CD8αα homodimer22,28, وهو غير فعاله مستقبلات مشتركه للإشارات TCR29. بالاضافه إلى ذلك ، فقد أظهرت هذه الخلاياCD8 + SP T القوية للخلايا الخلوية المستقلة TCR ، مما يجعل هذه الخلايا غير المواتية للاستخدام السريري30. يصف هذا البروتوكول أسلوبا حديثا ينطوي علي تحفيزخلايا CD8 +DP المنقية لتوليد خلاياCD8αβ + SP T ذات النمط الظاهري الأكثر تقليديه والمحسنة للخلايا الخلوية الخاصةبها. علي الرغم من ان فقدان خصوصية مستضد بسبب الثانوية TCRα اليليه أعاده ترتيب يحدث في مرحله موانئ دبي بعد طويلة الأمد الثقافة ، وهذا يمكن التغلب عليها من خلال تحرير الجينوم في T-iPSCs31. في تجربتنا ، والخلايا المستمدة من hiPSC موانئ دبي تبدا في الظهور في اليوم 30-35 من الثقافة ، وهذه الخلايا DP التي تم إنشاؤها حديثا لم تخضع بعد أعاده ترتيب TCRα الثانوية. لذلك ، تحتفظ معظم الخلايا DP في اليوم 35 خصوصية antigen ويمكن استخدامها لإنشاء خلاياCD8αβ + SP T الخاصة antigen.
قبل الإنسان المضادة لCD3 والتحفيز المضادة لCD28 في اليوم 35 ، يجبأزاله الخلايا CD8 DNمن الثقافة ، كما ثبت ان هذه تسبب القتل المباشر للخلايا +CD8 + موانئ دبي بعد التحفيز22. باستخدام التخصيب المغناطيسي الخرزة (الخطوة 3.10) سوف تثري لكل من موانئ دبي وCD8 +المتوسطة واحده ايجابيه (ISP) الخلايا1، والتي ثبت ان لدينا اي اثار سلبيه22. بدلا من ذلك ، يمكن اجراء فرز الخلايا المنشطة مضان بواسطة قياس التدفق الخلوي لعزل الخلايا DP. ومع ذلك ، يفضل الفصل المغناطيسي حبه لأنه يتجنب الإجهاد الميكانيكية الناجمة عن تدفق الخلوية.
جيلCD8αβ + SP T الخلايا من الخلايا الجذعية مستحث الإنسان دون التنشيط بوساطة اختيار ناهض وقد ثبت في وقت لاحق من خلال استخدام 3d الخلايا اللحمية الخلية الثقافة32. ومع ذلك ، الاختيار الفسيولوجية الايجابيه تعتمد علي التفاعل من TCR مع المجمعات الببتيد الذاتي-MHC ، والتي تتم معالجتها بشكل فريد والتي قدمتها الخلايا الظهاريه القشرية ثيميك33. وعلاوة علي ذلك, وقد ثبت تقارب TCR لاختيار الببتيدات لتحديد القدرات الوظيفية اللاحقة لCD8αβ الناضجة + SP T الخلايا34. حاليا ، لا يوجد اي دليل يوحي بان نظام الثقافة المشتركة القائم علي خليه الشق يمكن ان توفر الببتيد اختيار محدده ومعقده MHC المطلوبة للاختيار الفسيولوجية الايجابيه.
وقد تم الإبلاغ عنها سابقا في نموذج murine ان الخلايا T السلالة المتولدة من الورم مستضد الخاصة المشتقة من الخلايا الجذعية hiPSCs باستخدام OP9/DLL1 وحدها تفشل في تجربه النضج التقليدية. ومع ذلك ، فان الخلايا غير الناضجة المشتقة من ipsc التي تم إنشاؤها بواسطة نظام OP9/DLL1 يمكن ان تنضج إلى خلايا t ساذجه من خلال المزيد من التعليم الفسيولوجي الفيزيولوجي في نظام الثقافة 3d 28،35. ولذلك ، فان البروتوكول المقدم هنا لإنتاج الخلايا T غير ناضجه المستمدة iPSC المتولدة من نظام OP9/DLL1 أمر حيوي لمزيد من المحاولات لتوليد الإنسان الحقيقي مستضد الأورام البشرية الخاصة بالخلايا T التي يمكن ان تكون طويلة الأمد في الجسم الحي مع كفاءه لعلاج الأورام الوعائية الراسخة.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر الآن ب. Hoofring و رينا H. هو للمساعدة الرسوميه. وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث المجتمعية للمعهد الوطني للسرطان (ZIA BC010763) ومبادرة القمر الخاصة لسرطان الخلايا العصبية المناعية لعلاج السرطان القائم علي الخلية.
10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
Anti-CD3, human | BD Biosciences | Cat# 561812, RRID:AB_1089628 | |
Anti-CD34, human | BD Biosciences | Cat# 348791, RRID:AB_400381 | |
Anti-CD4, human | Biolegend | Cat# 344612, RRID:AB_2028479 | |
Anti-CD43, human | BD Biosciences | Cat# 560198, RRID:AB_1645460 | |
Anti-CD7, human | BD Biosciences | Cat# 555361, RRID:AB_395764 | |
Anti-CD8a, human | BD Biosciences | Cat# 555369, RRID:AB_398595 | |
Anti-CD8b, human | BD Biosciences | Cat# 641057, RRID:AB_1645747 | |
Anti-TCRb, human | BD Biosciences | Cat# 555548, RRID:AB_395932 | |
CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade | Miltenyl Biotec | 130-093-375 | |
CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade | Miltenyl Biotec | 130-093-387 | |
CD4 Microbeads, human | Miltenyl Biotec | 130-045-101 | |
Cell strainer 100 um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini | 100-500 | |
Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
Gelatin Solution 2% | SIGMA-Aldritch | G1393-100ML | |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine supplement |
HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free | Gibco | 14025-092 | |
Interleukin-2 | R&D Systems | 202-IL | |
Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV | MBL | Cat#TB-0009-2 | |
Mart1-hiPSC | Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 | RIKEN-IMS | |
Melan-A, MART 1 (26-35) | InnoPep | 3146-0100 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
αMEM powder | Gibco | 61100061 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Thermo Fisher Scientific | C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962 | |
OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | OP9/DLL1 |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | Human ESC Culture Media |
Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) | Tocris | 1254 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
StemPro | EZPassage | 23181-010 | |
T2-tumor | ATCC | T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™) | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
U Bottom 96 well plate | Corning, Inc. | 3799 |