التطهير البصري والتصوير من أنسجة الكلى المسماة بالمناعة
Summary
يسمح الجمع بين وضع العلامات على الأجسام المضادة، والمقاصة البصرية، والفحص المجهري الضوئي المتقدم، بإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد للهياكل أو الأجهزة الكاملة. يوصف هنا هو طريقة بسيطة للجمع بين وضع العلامات المناعية من شرائح الكلى سميكة، والمقاصة البصرية مع cinnamate إيثيل، والتصوير البؤري التي تمكن التصور والقياس الكمي للهياكل الكلوية ثلاثية الأبعاد.
Abstract
تقنيات المقاصة البصرية تجعل الأنسجة شفافة عن طريق معادلة مؤشر الانكسار في جميع أنحاء عينة للتصوير الثلاثي الأبعاد اللاحقة (3-D). وقد حظيت باهتمام كبير في جميع مجالات البحوث لإمكانية تحليل الهياكل المجهرية متعددة الخلايا التي تمتد على مسافات العيان. وبالنظر إلى أن أنابيب الكلى، والأوعية الدموية، والأعصاب، وغطاء الكلى تمتد في العديد من الاتجاهات، والتي تم التقاطها جزئيا فقط من قبل التقنيات التقليدية ثنائية الأبعاد حتى الآن، وتطهير الأنسجة فتحت أيضا العديد من المجالات الجديدة لبحوث الكلى. قائمة أساليب المقاصة البصرية تنمو بسرعة، ولكن لا يزال من الصعب للمبتدئين في هذا المجال لاختيار أفضل طريقة لسؤال بحثي معين. شريطة هنا هو طريقة بسيطة تجمع بين وضع العلامات الأجسام المضادة من شرائح الكلى الماوس سميكة. (أ) التطهير البصري باستخدام الإيثيل الإيثيلي الرخيص وغير السام والجاهزة للاستخدام؛ والتصوير البؤري. يصف هذا البروتوكول كيفية بث الكلى واستخدام خطوة استرجاع مستضد لزيادة ربط الأجسام المضادة دون الحاجة إلى معدات متخصصة. يتم عرض تطبيقه في تصوير هياكل متعددة الخلايا مختلفة داخل الكلى، ويتم معالجة كيفية استكشاف الأخطاء وإصلاحها سوء اختراق الأجسام المضادة في الأنسجة. كما نناقش الصعوبات المحتملة في تصوير الفلوروفورس الذاتية والحصول على عينات كبيرة جدا وكيفية التغلب عليها. يوفر هذا البروتوكول البسيط أداة سهلة الإعداد وشاملة لدراسة الأنسجة في ثلاثة أبعاد.
Introduction
وقد أدى الاهتمام المتزايد بدراسة أعضاء كاملة أو هياكل كبيرة متعددة الخلايا إلى تطوير أساليب التطهير البصري التي تنطوي على تصوير الأنسجة الشفافة في ثلاثة أبعاد. حتى وقت قريب، كانت أفضل الطرق لتقدير عدد الخلايا، وطول، أو حجم الهياكل كلها ستيريوي أو مقطع تسلسلي شامل، والذي يقوم على أخذ العينات النظامية من الأنسجة لتحليلها في وقت لاحق في بعدين1، 2 , 3– ومع ذلك، فإن هذه الأساليب تستغرق وقتاطويلا وتحتاج إلى مستوى عال من التدريب والخبرة 4. طرق المقاصة البصرية التغلب على هذه المشاكل عن طريق معادلة مؤشر الانكسار في جميع أنحاء عينة لجعل الأنسجة شفافة للتصوير 3-D5،6،7.
وقد تم تطوير عدة طرق للتطهير البصري تندرج في فئتين رئيسيتين: الأساليب القائمة على المذيبات والأساليب القائمة على مائي. يمكن تقسيم الأساليب المائية إلى غمربسيط 8،9،هايبرأوهدينغ10،11،وهيدروجيل التضمين12،13. الطرق القائمة على المذيبات تجفيف الأنسجة، وإزالة الدهون وتطبيع مؤشر الانكسار إلى قيمة حوالي 1.55. القيود المفروضة على معظم الأساليب القائمة على المذيبات هي تبريد الفلورة الذاتية من البروتينات مراسل شائعة الاستخدام مثل GFP، سمية المذيبات، والقدرة على حل الغراء المستخدمة في بعض غرف التصوير أو العدسات الموضوعية، وانكماش الأنسجة خلال الجفاف14،15،16،17،18،19،20،21. ومع ذلك، الطرق القائمة على المذيبات بسيطة، وكفاءة الوقت، ويمكن أن تعمل في عدد من أنواع الأنسجة المختلفة.
تعتمد الطرق المائية على غمر الأنسجة في الحلول المائية التي تحتوي على مؤشرات انكسار في نطاق 1.38-1.528و11و12و22و23و24 . وقد وضعت هذه الأساليب للحفاظ على انبعاث البروتين مراسل الفلورسنت الذاتية ومنع الانكماش الناجم عن الجفاف، ولكن القيود المفروضة على معظم أساليب المقاصة المائية تشمل مدة أطول من البروتوكول، وتوسيع الأنسجة، و تعديل البروتين (أي إزالة الصبغة الجزئية للبروتينات عن طريق اليوريا فيبروتوكولات ترطيب مفرط مثل ScaleA2) 7،11،23،25. تناول ScaleS توسع الأنسجة من خلال الجمع بين اليوريا مع السوربيتول، والتي توازن عن طريق الجفاف توسع الأنسجة الناجمة عن اليوريا، والحفاظ على البنية الفوقية للأنسجة كما تم تقييمها من قبل المجهر الإلكتروني10. يؤثر انكماش الأنسجة أو توسعها على الأحجام المطلقة للهياكل أو المسافات بين الكائنات أو كثافة الخلايا لكل وحدة تخزين. وبالتالي، فإن قياس التغيرات في الحجم عند إزالة الأنسجة قد يساعد على تفسير النتائج التي تم الحصول عليها7،26.
بشكل عام، يتكون بروتوكول التنظيف البصري من خطوات متعددة، بما في ذلك المعالجة المسبقة، ونفاذية، ووسم المناعة (إذا لزم الأمر)، ومطابقة مؤشر الانكسار، والتصوير مع الفحص المجهري الضوئي المتقدم (على سبيل المثال، اثنين من الفوتون، أو البؤرة، أو ضوء ورقة الفلورة المجهرية). وقد وضعت معظم نُهُج المقاصة لتصور الأنسجة العصبية، وقد أثبتت الدراسات الناشئة تطبيقها في أجهزة أخرى5. وقد ثبت من قبل هذه الأداة الشاملة للسماح بتحليل موثوق وفعال لهياكل الكلى، بما في ذلك الكلى27،28،التسلل المناعي28،الأوعية الدموية28،وشرائح الأنابيب 29، وهو نهج مثالي لتحسين فهم وظيفة الكبيبي والأنابيب إعادة عرض في الصحة والمرض.
ملخصة هنا هو طريقة تعتمد على المذيبات التي تجمع بين تلطيخ المناعة من أنابيب الكلى. التطهير البصري مع رخيصة، غير سامة، وجاهزة للاستخدام الكيميائية إيثيل سينامات (ECi)؛ والتصوير المجهري البؤري الذي يسمح بالتصور الأنبوبي الكامل والقياس الكمي. هذه الطريقة بسيطة، تجمع بين مستضد استرجاع شرائح الكلى مع تلطيخ الأجسام المضادة التجارية، ولا تتطلب معدات متخصصة، مما يجعلها في متناول معظم المختبرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد حظيت تقنيات التطهير البصري باهتمام واسع النطاق للتصور ثلاثي الأبعاد والقياس الكمي للتشريح المجهري في مختلف الأجهزة. هنا، تم الجمع بين طريقة المقاصة القائمة على المذيبات (ECi) مع وضع العلامات المناعية للتصوير ثلاثي الأبعاد للأنابيب الكاملة في شرائح الكلى. هذه الطريقة بسيطة وغير مكلفة و…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S. بدعم من المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية DFG (332853055)، آخر Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197)، وكلية الطب في RWTH آخن (RWTH برنامج العائدين). V. G. P. بدعم من زمالات بحثية من دويتشه جيسيلشافت فور كلورولوجي، ومؤسسة ألكسندر فون هومبولدت، والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا. D. H. E بدعم من مؤسسة LeDucq. ويتلقى ر. ك. الدعم من المنح المقدمة من وزارة المالية (KR-4073/3-1 وSCHN1188/5-1 وSFB/TRR57 وSFB/TRR219) وولاية نورثراينويستفاليا (MIWF-NRW) والمركز المتعدد التخصصات للبحوث السريرية في جامعة RWTH Aachen (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
References
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
