ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד
Summary
השילוב של תיוג נוגדנים, ניקוי אופטי, ומיקרוסקופ אור מתקדם מאפשר ניתוח תלת מימדי של מבנים או איברים מושלמים. המתואר כאן היא שיטה פשוטה לשלב אימונויניום של פרוסות כליות עבות, ניקוי אופטי עם cinnamate אתיל, והדמיה מיקוד המאפשר הדמיה וכימות של מבנים תלת ממדיים כליה.
Abstract
שיטות ניקוי אופטי להפוך את רקמת שקוף על ידי הפחתת מדד השבירה לאורך מדגם עבור הדמיה תלת מימדי בעקבות (3-D). הם זכו לתשומת לב רבה בכל תחומי המחקר של הפוטנציאל לנתח מבנים מיקרוסקופיים מרחבי האזור המתפרסים על פני מרחקים מאקרוסקופיים. בהינתן כי tubules כליה, ואצלב, עצבים, ופקולי להאריך בכיוונים רבים, אשר נתפסו רק חלקית על ידי טכניקות דו ממדיות מסורתיות עד כה, ניקוי רקמות גם פתח אזורים חדשים רבים של מחקר כליות. רשימת שיטות הסליקה האופטיות גדלה במהירות, אך היא נותרת קשה למתחילים בשדה זה כדי לבחור את השיטה הטובה ביותר לשאלת מחקר נתונה. בתנאי כאן היא שיטה פשוטה המשלבת התיוג נוגדנים של פרוסות כליה עבה העכבר; ניקוי אופטי עם זול, לא רעיל ומוכן לשימוש כימי אתיל cinnamate; והדמיה ממוחשבת. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפעיל את הכליות ולהשתמש בצעד לאחזור אנטיגן כדי להגדיל את הנוגדן מבלי לדרוש ציוד מיוחד. היישום שלה מוצג הדמיה של מבנים שונים מגוונים בתוך הכליה, וכיצד לפתור חדירה של נוגדנים עניים לתוך רקמות ממוען. אנחנו גם לדון בקשיים פוטנציאליים של הדמיה מיאלואידית fluorophores ורכישת דגימות גדולות מאוד ואיך להתגבר עליהם. פרוטוקול זה פשוט מספק כלי קל להתקנה ומקיף כדי ללמוד רקמות בשלושה מימדים.
Introduction
העניין הגובר בלימוד איברים שלמים או מבנים מרחבי היקף גדולים הובילו לפיתוח שיטות סליקה אופטיות המערבות הדמיה של רקמה שקופה בשלושה מימדים. עד לאחרונה, השיטות הטובות ביותר להערכת מספר התא, אורך, או כמות של מבנים שלמים היו סטריאולוגיה או שיקוף סדרתי ממצה, אשר מבוססת על דיגום מערכתי של רקמות לניתוח הבאים בשני ממדים1, מיכל השני , 3. עם זאת, שיטות אלה צורכת זמן רב וזקוקים לרמה גבוהה של אימון ומומחיות4. שיטות ניקוי אופטי להתגבר על בעיות אלה על ידי הפחתת מדד השבירה לאורך מדגם כדי להפוך את רקמת שקוף להדמיה תלת-ממדית5,6,7.
מספר שיטות ניקוי אופטי פותחו אשר ליפול שתי קטגוריות עיקריות: הממס מבוססי שיטות מבוססות מימית. שיטות מבוססות מים ניתן לחלק עוד לטבילה פשוטה8,9, היפרחות10,11, ו הידרוג’ל הטבעה12,13. שיטות מבוססות ממס מייבשים את הרקמה, מסירים שומנים ומנרמל את מדד השבירה לערך סביב 1.55. מגבלות של רוב השיטות המבוססות על הממס הם המקוטטים של קרינה אנדוגניים של חלבונים העיתונאי הנפוץ בשימוש כגון GFP, רעילות ממס, יכולת לפזר דבקים המשמשים כמה חדרי הדמיה או עדשות אובייקטיבי, ואת הצטמקות של רקמות במהלך , התייבשות14,15,16.17,18,19,20,21 עם זאת, שיטות מבוססות-ממס הן פשוטות, יעילות בזמן, ויכולות לעבוד במספר סוגי רקמות שונים.
שיטות מבוססות מים להסתמך על טבילה של הרקמה בפתרונות מימית כי יש מדדי השבירה בטווח של 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . שיטות אלה פותחו כדי לשמר את החלבון אנדוגני של כתבת פלורסנט ולמנוע הצטמקות המושרה, אבל מגבלות של רוב מימית מבוססי שיטות סליקה כוללים משך זמן ארוך יותר של הפרוטוקול, הרחבת רקמות, ו שינוי חלבון (כלומר דנטורציה חלקית של חלבונים על ידי אוריאה בפרוטוקולים היפרליחות כגון סקהלהA2)7,11,23,25. הרחבת הרקמה מפנה שתנן עם sorbitol, אשר מאזנת נגד ידי התייבשות הרחבת רקמות אוריאה-המושרה, ושימר את מבנה בדיקת הרקמה כפי שמוערך על ידי אלקטרון מיקרוסקופ10. הצטמקות רקמות או התרחבות משפיעים על הגדלים המוחלט של מבנים, מרחקים בין אובייקטים או צפיפות תא לכל אמצעי אחסון; כך, מדידת גודל שינויים על ניקוי של הרקמה עשויה לעזור לפרש את התוצאות המתקבלות7,26.
באופן כללי, פרוטוקול לניקוי אופטי מורכב ממספר שלבים, כולל טיפול מקדים, חדירות, אימונואולבלינג (במידת הצורך), התאמת מדד השבירה והדמיה עם מיקרוסקופ אור מתקדם (למשל, שני פוטון, מוקד, או מיקרוסקופ אור-זריחה מגיליון קל). רוב הגישות המסלקות פותחו כדי להמחיש את הרקמה העצבית, ומחקרים מתפתחים מאומתים את יישומם באיברים אחרים5. זה כלי מקיף כבר הפגינו בעבר כדי לאפשר ניתוח אמין ויעיל של מבנים כליות, כולל פקיולי27,28, החיסונית מחלחל28, ואסיקובלטורה28, ומגזרים כדורית 29, וזה גישה אידיאלית להבנה טובה יותר של תפקוד הפקפיות ושיפוץ כדורית בריאות ומחלות.
מסוכם כאן היא שיטה מבוססת ממס המשלבת כתמים חיסוני של tubules כליה; ניקוי אופטי עם זול, לא רעיל, ומוכן לשימוש כימי אתיל cinnamate (אי סי אי); והדמיה מיקרוסקופית הקונטוקלית המאפשרת הדמיה וכימות מלאה. שיטה זו היא פשוטה, משלבת אנטיגן-איחזור של פרוסות כליות עם כתמים של נוגדנים מסחריים, ואינו דורש ציוד מיוחד, מה שהופך אותו לנגיש לרוב המעבדות.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות ניקוי אופטי זכו לתשומת לב רבה להדמיה תלת-ממדית ולקוונפיקציה של מיקרואנטומיה באיברים שונים. כאן, שיטת סליקה מבוססת ממס (אי סי אי) היתה משולבת עם אימונויניום עבור הדמיה תלת-ממדית של הפקעת שלמות בפרוסות כליה. שיטה זו פשוטה, זולה ומהירה. עם זאת, שאלות מחקר אחרות עשויות לענות באופן הטוב ב…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S. נתמך על ידי מענקים מן הקרן DFG המחקר הגרמני (332853055), אחר Krner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), ואת הפקולטה לרפואה של אאכן (RWTH התוכנית ריטרנר). V. ג. פ. נתמך על ידי מלגות מחקר מתוך הפרווה הלאומית של דויטשה גיישכטר, קרן אלכסנדר פון הומבולדט, והמועצה לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה. ד. ה. ה. נתמך על ידי פונפה לדקיו. ר. ק. נתמך על ידי מענקים של DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), המדינה של Norhinewestfalia (MIWF-NRW) ואת המרכז הבינתחומי למחקר קליני ב RWTH האוניברסיטה של אאכן (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
References
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
