इम्यूनोलेबल्ड किडनी ऊतक की ऑप्टिकल क्लियरिंग और इमेजिंग
Summary
एंटीबॉडी लेबलिंग, ऑप्टिकल समाशोधन, और उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संयोजन पूर्ण संरचनाओं या अंगों के तीन आयामी विश्लेषण की अनुमति देता है। यहाँ वर्णित मोटी गुर्दे स्लाइस के इम्यूनोलेबलिंग गठबंधन करने के लिए एक सरल तरीका है, एथिल cinnamate के साथ ऑप्टिकल समाशोधन, और confocal इमेजिंग कि दृश्य और तीन आयामी गुर्दे संरचनाओं के परिमाण सक्षम बनाता है.
Abstract
ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक बाद में तीन आयामी (3-डी) इमेजिंग के लिए एक नमूना भर में अपवर्तक सूचकांक को बराबर करके ऊतक पारदर्शी प्रदान करते हैं। वे सूक्ष्म multicellular संरचनाओं कि स्थूल दूरी पर विस्तार का विश्लेषण करने की क्षमता के लिए सभी अनुसंधान क्षेत्रों में महान ध्यान प्राप्त किया है. यह देखते हुए कि गुर्दे के ट्यूबल, vascuules, vascuuleture, नसों, और glomeruli कई दिशाओं में विस्तार, जो केवल आंशिक रूप से पारंपरिक दो आयामी तकनीकों द्वारा अब तक कब्जा कर लिया गया है, ऊतक समाशोधन भी गुर्दे अनुसंधान के कई नए क्षेत्रों को खोला. ऑप्टिकल समाशोधन तरीकों की सूची तेजी से बढ़ रहा है, लेकिन यह इस क्षेत्र में शुरुआती के लिए एक दिया अनुसंधान प्रश्न के लिए सबसे अच्छा तरीका चुनने के लिए मुश्किल रहता है. लेकिन यहाँ एक सरल तरीका है कि मोटी माउस गुर्दे स्लाइस के एंटीबॉडी लेबलिंग को जोड़ती है; सस्ते, गैर विषैले और तैयार करने के लिए उपयोग रासायनिक एथिल cinnamate के साथ ऑप्टिकल समाशोधन; और confocal इमेजिंग. इस प्रोटोकॉल गुर्दे perfuse और विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना एंटीबॉडी बाइंडिंग बढ़ाने के लिए एक प्रतिजन-पुनर्प्राप्ति कदम का उपयोग करने के लिए कैसे वर्णन करता है। इसके आवेदन गुर्दे के भीतर विभिन्न multicellular संरचनाओं इमेजिंग में प्रस्तुत किया है, और कैसे ऊतक में गरीब एंटीबॉडी प्रवेश समस्या निवारण को संबोधित किया है. हम भी इमेजिंग अंतर्जात fluorophores की संभावित कठिनाइयों पर चर्चा और बहुत बड़े नमूने प्राप्त करने और उन्हें कैसे दूर करने के लिए. यह सरल प्रोटोकॉल तीन आयामों में ऊतक का अध्ययन करने के लिए एक आसान करने के लिए सेटअप और व्यापक उपकरण प्रदान करता है।
Introduction
पूरे अंगों या बड़े multicellular संरचनाओं के अध्ययन में बढ़ती रुचि ऑप्टिकल समाशोधन तरीकों है कि तीन आयामों में पारदर्शी ऊतक के इमेजिंग शामिल के विकास के लिए नेतृत्व किया है. हाल ही में जब तक, सेल संख्या, लंबाई, या पूरे संरचनाओं की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए सबसे अच्छा तरीके स्टीरियोलॉजी या संपूर्ण धारावाहिक अनुभागीकरण किया गया है, जो दो आयामों में बाद के विश्लेषण के लिए ऊतक के प्रणालीगत नमूने पर आधारित है1, २ , 3. हालांकि, इन तरीकों समय लेने वाली हैं और प्रशिक्षण और विशेषज्ञता4के एक उच्च स्तर की जरूरत है. ऑप्टिकल समाशोधन विधियों ने इन समस्याओं को एक नमूने में अपवर्तक सूचकांक को बराबर करके 3-डी इमेजिंग5,6,7के लिए ऊतक को पारदर्शी बनाने के लिए दूर किया .
विलायक आधारित और जलीय आधारित तरीकों: कई ऑप्टिकल समाशोधन तरीकों जो दो मुख्य श्रेणियों में गिर विकसित किया गया है। जलीय आधारित विधियों को सरल विसर्जन8,9,हाइपरहाइड्रेशन10,11और हाइड्रोजेल में विभाजित किया जा सकता है 12,13. विलायक आधारित तरीके ऊतक निर्जलित, लिपिड को हटाने और 1.55 के आसपास एक मूल्य के लिए अपवर्तक सूचकांक सामान्य। सबसे विलायक आधारित तरीकों की सीमाएं इस तरह के GFP, विलायक विषाक्तता, कुछ इमेजिंग कक्षों या उद्देश्य लेंस में इस्तेमाल गोंद भंग करने की क्षमता के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल किया रिपोर्टर प्रोटीन के अंतर्जात फ्लोरोसेंट की शमन कर रहे हैं, और के दौरान ऊतक के संकुचन निर्जलीकरण14,15,16,17,18,19,20,21. हालांकि, विलायक आधारित तरीके सरल, समय कुशल हैं, और विभिन्न ऊतक प्रकार के एक नंबर में काम कर सकते हैं।
जलीय-आधारित विधियाँ जलीय समाधानों में ऊतक के विसर्जन पर निर्भर करती हैं जिनमें 1.38-1.528,11,12,22,23,24 की श्रेणी में अपवर्तक सूचकांक होते हैं . इन तरीकों अंतर्जात फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन उत्सर्जन को बनाए रखने और निर्जलीकरण प्रेरित संकुचन को रोकने के लिए विकसित किए गए थे, लेकिन सबसे जलीय आधारित समाशोधन तरीकों की सीमाओं प्रोटोकॉल की एक लंबी अवधि शामिल, ऊतक विस्तार, और प्रोटीन संशोधन (अर्थात हाइपरहाइड्रेटिंग प्रोटोकॉल जैसे एससी ले ए 2)7,11,23,25में यूरिया द्वारा प्रोटीन का आंशिक विकृतीकरण . ScaleS संबोधित ऊतक विस्तार sorbitol के साथ यूरिया के संयोजन के द्वारा, जो यूरिया प्रेरित ऊतक विस्तार निर्जलीकरण द्वारा counterbalances, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी10द्वारा मूल्यांकन के रूप में ऊतक अल्ट्रास्ट्रक्चर संरक्षित. ऊतक संकुचन या विस्तार संरचनाओं के पूर्ण आकार, वस्तुओं के बीच की दूरी, या प्रति मात्रा सेल घनत्व को प्रभावित करता है; इस प्रकार ऊतक के समाशोधन में आकार परिवर्तन का मापन प्राप्त परिणामों की व्याख्या करने में मदद कर सकताहै 7,26.
सामान्य में, ऑप्टिकल समाशोधन के लिए एक प्रोटोकॉल pretreatment, permebilization, इम्यूनोलेबलिंग (यदि आवश्यक हो), अपवर्तक सूचकांक मिलान, और उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग सहित कई कदम होते हैं (जैसे, दो-फोटो, confocal, या प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी). अधिकांश समाशोधन दृष्टिकोण न्यूरोनल ऊतक की कल्पना करने के लिए विकसित किया गया है, और उभरते अध्ययन अन्य अंगों में उनके आवेदन को मान्य किया है5. इस व्यापक उपकरण पहले से गुर्दे की संरचनाओं के विश्वसनीय और कुशल विश्लेषण की अनुमति देने के लिए प्रदर्शन किया गया है, glomeruli27सहित ,28, प्रतिरक्षा घुसपैठ28, vasculature28, और ट्यूबल क्षेत्रों 29, और यह बेहतर glomerular समारोह और स्वास्थ्य और रोग में ट्यूबल remodeling की समझ के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण है.
यहाँ संक्षेप में एक विलायक आधारित विधि है कि गुर्दे नलिका के इम्यूनोस्टेनिंग को जोड़ती है; सस्ते, गैर विषैले, और तैयार करने के लिए उपयोग रासायनिक एथिल cinnamate (ECi) के साथ ऑप्टिकल समाशोधन; और confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग कि पूरा ट्यूब्यूल दृश्य और परिमाणीकरण की अनुमति देता है. इस विधि सरल है, वाणिज्यिक एंटीबॉडी के धुंधला के साथ गुर्दे स्लाइस के प्रतिजन-पुनर्प्राप्ति को जोड़ती है, और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, जो यह सबसे प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बनाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक 3-डी दृश्य और विभिन्न अंगों में microanatomy के परिमाणीकरण के लिए व्यापक ध्यान प्राप्त किया है. यहाँ, विलायक आधारित समाशोधन विधि (ECi) गुर्दे स्लाइस में पूरे ट्यूबल के 3-डी इमेजिंग के लिए इम्य…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
टी एस DFG जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (332853055), अन्य Kr$ner-Fresenius-Stiftung (2015-A197) से अनुदान द्वारा समर्थित है, और RWTH Aachen के चिकित्सा संकाय (आरडब्ल्यूटीरिटर्नर कार्यक्रम). वी जी पी ड्यूश Gesellschaft फर नेफ्रोलोजी, अलेक्जेंडर वॉन Humboldt फाउंडेशन, और ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद से अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित है। D. H. E Fondation LeDucQ द्वारा समर्थित है। आर के DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), Northrhinewestfalia के राज्य (MIWF-NRW) और RWTH Aachen विश्वविद्यालय में नैदानिक अनुसंधान के लिए अंतःविषय केंद्र (O3-11) से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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