면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰
Summary
항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.
Abstract
광학 클리어링 기술은 후속 3차원(3차원) 이미징을 위해 샘플 전체에 걸쳐 굴절률을 평형화하여 조직을 투명하게 만듭니다. 그(것)들은 거시적인 거리를 통해 확장하는 현미경 다세포 구조물을 분석하는 잠재력을 위한 모든 연구 지역에 있는 큰 관심을 받았습니다. 신장 tubules, 혈관, 신경 및 사구체가 많은 방향으로 확장한다는 것을 감안할 때, 지금까지 전통적인 2 차원 기술에 의해 부분적으로 포착된, 조직 정리는 또한 신장 연구의 많은 새로운 지역을 열었습니다. 광학 클리어링 방법의 목록은 빠르게 성장하고 있지만,이 분야의 초보자가 주어진 연구 질문에 가장 적합한 방법을 선택하는 것은 여전히 어렵습니다. 여기에 제공된 두꺼운 마우스 신장 슬라이스의 항체 라벨링을 결합하는 간단한 방법이 있다; 저렴하고 무독성이며 즉시 사용할 수있는 화학 물질 인 에틸 시나 메이트 (ethyl cinnamate)가있는 광학 클리어링; 및 공초점 이미징. 이 프로토콜은 신장을 침투시키고 항원 회수 단계를 사용하여 항체-결합을 증가시키는 방법을 전문 장비를 필요로 하지 않고 설명한다. 그것의 응용은 신장 내의 다른 다세포 구조물을 화상 진찰에서 제출되고, 조직에 나쁜 항체 침투를 해결하는 방법은 해결됩니다. 우리는 또한 내인성 형광을 화상 진찰의 잠재적인 어려움및 아주 큰 견본을 취득하고 그(것)들을 극복하는 방법 토론합니다. 이 간단한 프로토콜은 3차원으로 조직을 연구할 수 있는 설치가 간편하고 포괄적인 도구를 제공합니다.
Introduction
전체 기관 또는 큰 다세포 구조를 공부에 대한 관심이 증가함에 따라 투명 조직의 이미징을 3차원으로 포함하는 광학 클리어링 방법의 개발이 이해지고 있습니다. 최근까지, 전체 구조의 세포 수, 길이 또는 부피를 추정하는 가장 좋은 방법은 2 차원 1에서 후속 분석을위한 조직의 전신샘플링을 기반으로 하는 입체학 또는 철저한 직렬 단면입니다. 2개 , 3. 그러나 이러한 방법은 시간이 많이 걸리며 높은 수준의 교육 및 전문 지식이 필요합니다4. 광학 클리어링 방법은3D 이미징5,6,7에대한 조직을 반투명하게 만들기 위해 샘플 전체에 걸쳐 굴절률을 평형화함으로써 이러한 문제를 극복한다.
용매 기반 및 수성 기반 방법의 두 가지 주요 범주로 속하는 몇 가지 광학 청산 방법이 개발되었습니다. 수성 기반 방법은 더 간단한 침수 8,9,과수10,11,및 하이드로겔 포함12,13으로나눌 수 있다. 용매 기반 방법은 조직을 탈수시키고, 지질을 제거하고, 굴절률을 약 1.55값으로 정상화한다. 대부분의 용매 기반 방법의 한계는 GFP, 용매 독성, 일부 이미징 챔버 또는 객관적렌즈에 사용되는 접착제를 용해하는 능력, 그리고 동안 조직의 수축과 같은 일반적으로 사용되는 리포터 단백질의 내인성 형광의 담금질입니다. 탈수14,15,16,17,18,19,20,21. 그러나, 용매 기반 방법은 간단하고 시간 효율적이며 다양한 조직 유형에서 작동할 수 있다.
수성 기반 방법은 1.38-1.528,11,12,22,23,24 범위의 굴절 지수가있는 수성 용액에 조직의 침지에 의존합니다. . 이러한 방법은 내인성 형광 리포터 단백질 방출을 보존하고 탈수 유발 수축을 방지하기 위해 개발되었지만, 대부분의 수성 계 청산 방법의 한계는 프로토콜의 더 긴 지속 기간, 조직 확장, 및 단백질 변형 (즉, ScaleA2와 같은 과수성 프로토콜에서 요소로 단백질의 부분 변성) 7,11,23,25. ScaleS는 요소-유도 조직 확장을 탈수시킴으로써 균형을 이룬 소르비톨과 우레아를 결합하여 조직 확장을 해결하고, 전자 현미경 검사법10에의해 평가된 바와 같이 조직 초구조를 보존하였다. 조직 수축 또는 확장은 구조물의 절대 크기, 물체 사이의 거리 또는 부피당 세포 밀도에 영향을 미칩니다. 따라서, 조직의 정리 시 크기 변화의 측정은 얻어진결과 7,26을해석하는 데 도움이 될 수 있다.
일반적으로 광학 클리어링을 위한 프로토콜은 전처리, 투과, 면역 라벨링(필요한 경우), 굴절률 매칭 및 고급 광 현미경(예: 2광자, 공초점 또는 광시트 형광 현미경 검사법). 대부분의 클리어링 접근법은 신경 조직을 시각화하기 위해 개발되었으며, 새로운 연구는 다른장기에서 의 응용 프로그램을 검증했습니다 5. 이 포괄적인 도구는 사구체27,28,면역 침투28, 혈관 구조28,및 수관 분절을 포함하여 신장 구조의 안정적이고 효율적인 분석을 허용하는 것으로 이전에 입증되었습니다. 29,그것은 건강과 질병에 사구 기능 및 tubule 리모델링의 이해를 더 나은 이상적인 접근이다.
여기서 요약하면 신장 관의 면역 염색을 결합하는 용매 기반 방법이다. 저렴하고 무독성이며 즉시 사용이 간 화학 물질인 에틸 시나메이트(ECi)가 있는 광학 클리어링; 완전한 수화 시각화 및 정량화를 허용하는 공초점 현미경 이미징. 이 방법은 간단하고, 신장 슬라이스의 항원 회수와 상업용 항체의 얼룩을 결합하며, 대부분의 실험실에서 접근 할 수있는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
광학 클리어링 기술은 다양한 장기에서 미세 해부학의 3차원 시각화 및 정량화에 대해 폭넓은 관심을 받고 있습니다. 여기서, 용매계 클리어링 방법(ECi)을 신장 슬라이스에서 전체 튜블의 3차원 이미징을 위한 면역 라벨링과 결합하였다. 이 방법은 간단하고 저렴하며 빠를 수 있습니다. 그러나 다른 연구 질문은 다른 클리어링 프로토콜5로 가장 잘 대답 할 수 있습니다. 또한 용매…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S.는 DFG 독일 연구 재단 (332853055), 엘스 크뢰너 – 프레세니우스 – 스티퉁 (2015_A197), RWTH 아헨의 의료 학부 (RWTH 반환 자 프로그램)의 보조금에 의해 지원됩니다. V. G. P. 도이치 Gesellschaft 모피 Nephrologie, 알렉산더 폰 훔볼트 재단, 그리고 호주의 국립 건강 및 의료 연구 위원회에서 연구 펠로우십에 의해 지원됩니다. D. H. E는 레덕크 폰디에 의해 지원됩니다. R. K.는 DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), 노스리뉴스트팔리아 주(MIWF-NRW) 및 RWTH 아헨 대학교의 임상 연구를 위한 학제간 센터(O3-11)의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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