Оптическая очистка и визуализация иммуномаркированных тканей почек
Summary
Сочетание маркировки антител, оптической очистки и передовой световой микроскопии позволяет трехмерный анализ полных структур или органов. Описанный здесь простой метод для объединения иммуномаркировки толстых ломтиков почек, оптическая очистка с этиловый циннамат, и конфокальная визуализация, которая позволяет визуализации и количественной оценки трехмерных структур почек.
Abstract
Методы оптической очистки делают ткань прозрачной, уравновешись рефракционным индексом во всем образце для последующего трехмерного (3-D) изображения. Они получили большое внимание во всех областях исследований для потенциального анализа микроскопических многоклеточных структур, которые простираются на макроскопические расстояния. Учитывая, что почечные трубочки, сосуды, нервы и гломерули распространяются во многих направлениях, которые были лишь частично захвачены традиционными двумерными методами до сих пор, очистка тканей также открыла много новых областей исследований почек. Список методов оптической очистки быстро растет, но новичкам в этой области по-прежнему трудно выбрать наилучший метод для заданного исследовательского вопроса. При условии, здесь простой метод, который сочетает в себе антитела маркировки толстых ломтиков мыши почки; оптическая очистка с дешевым, нетоксичным и готовым к использованию химическим этилцином; и конфокальной визуализации. Этот протокол описывает, как пронзать почки и использовать антиген-поиск шаг для увеличения антитела-связывания, не требуя специализированного оборудования. Его применение представлено в визуализации различных многоклеточных структур в почках, и как устранить неполадки плохое проникновение антител в ткани рассматривается. Мы также обсуждаем потенциальные трудности визуализации эндогенных флюорофоров и приобретения очень больших образцов и как их преодолеть. Этот простой протокол обеспечивает простой в настройке и всеобъемлющий инструмент для изучения тканей в трех измерениях.
Introduction
Растущий интерес к изучению целых органов или крупных многоклеточных структур привел к разработке методов оптической очистки, которые включают визуализацию прозрачной ткани в трех измерениях. До недавнего времени лучшими методами оценки количества клеток, длины или объема целых структур были стереология или исчерпывающее последовательное секционирование, которое основано на системной выборке ткани для последующего анализа в двух измерениях1, 2 , 3. Однако эти методы отнимают много времении нуждаются в высоком уровне подготовки и опыта 4. Методы оптической очистки преодолевают эти проблемы, уравновешивает рефракционный индекспо всему образцу, чтобы сделать ткани полупрозрачными для 3-D изображения 5,6,7.
Разработано несколько методов оптической очистки, которые подпадают под две основные категории: методы на основе растворителя и aqueous. Методы на основе aqueous можно далееразделить на простое погружение 8,9,гипергидратацию10,11и гидрогель встраивание12,13. Методы на основе растворов обезвоживают ткани, удаляют липиды и нормализуют рефракционный индекс до значения около 1,55. Ограничения большинства методов на основе растворителя являются уторение эндогенной флуоресценции широко используемых белков репортера, таких как GFP, токсичность растворителя, способность растворять клеи, используемые в некоторых камерах изображения или объективных линзах, и усадка тканей во время обезвоживание14,15,16,17,18,19,20,21. Тем не менее, методы на основе растворителя просты, экономичны по времени и могут работать в различных типах тканей.
Aqueous-основанные методы полагаются на погружении ткани в aqueous разрешения которые имеют рефракционные indicesв ряде 1.38-1.52 8,11,12,22,23,24 . Эти методы были разработаны для сохранения эндогенных флуоресцентных белков ырепортера и предотвращения усадки, вызванной обезвоживанием, но ограничения большинства вспомогательных методов очистки включают более длительную продолжительность протокола, расширение тканей и белковая модификация (т.е. частичная денатурация белков мочевиной в протоколах гипергидратации, таких как ScaleA2) 7,11,23,25. ScaleS обратился к расширению тканей путем объединения мочевины с сорбитол, который уравновешивает путем обезвоживания мочевины индуцированной ткани расширения, и сохранил ткани ультраструктуры, как оценивается электронной микроскопии10. Усадка или расширение тканей влияет на абсолютные размеры структур, расстояния между объектами или плотность клеток на объем; Таким образом, измерение изменений размера при очисткеткани может помочь интерпретировать полученные результаты 7,26.
В целом, протокол оптической очистки состоит из нескольких этапов, включая предварительную обработку, permeabilization, иммуномаркировку (при необходимости), соответствие рефракционного индекса и визуализацию с продвинутой световой микроскопией (например, двухфотон, confocal, или светлистой флуоресценции микроскопии). Большинство подходов к очистке были разработаны для визуализации нейронной ткани, и новые исследования подтвердили их применение в других органах5. Этот комплексный инструмент был ранее продемонстрирован, чтобы обеспечить надежный и эффективный анализ структур почек, в том числе glomeruli27,28, иммунные инфильтраты28, сосуды28, и тулупер сегментов 29, и это идеальный подход к лучшему пониманию гломерулярной функции и переделки трубок в области здоровья и болезней.
Обобщен здесь метод на основе растворителя, который сочетает в себе иммуностогирование почечных труб; оптическая очистка с дешевым, нетоксичным и готовым к использованию химическим этилцином (ECi); и конфокальная микроскопическая визуализация, которая позволяет полную визуализацию и количественную оценку труб. Этот метод прост, сочетает в себе антиген-извлечение ломтиков почек с окрашиванием коммерческих антител, и не требует специализированного оборудования, что делает его доступным для большинства лабораторий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы оптической очистки получили широкое внимание для трехмерной визуализации и количественной оценки микроанатомии в различных органах. Здесь метод очистки на основе растворителя (ECi) сочетался с иммуномаркировкой для трех-D-изображения целых трубок в почках. Этот метод прост, недо…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Т. С. поддерживается грантами немецкого исследовательского фонда DFG (332853055), Else Kr’ner-Fresenius-Stiftung (2015-A197) и медицинским факультетом RWTH Aachen (Программа RWTH Returner). V. G. P. поддерживается научными стипендиями от Deutsche Gesellschaft меха Nephrologie, Александр фон Гумбольдт Фонда, и Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии. D. H. E поддерживается Фондом LeDucq. Р. К. поддерживается грантами DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), штата СеверныйВестфалия (MIWF-NRW) и Междисциплинарного центра клинических исследований при Университете RWTH Aachen (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
References
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
