JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Published: July 22, 2019
doi:
10.3791/60002
, , , ,
1Division of Nephrology and Clinical Immunology,University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine,University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology,Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension,Oregon Health and Science University, 5Renal Section,Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation,Erasmus Medical Center

Summary

Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.

Abstract

Optik temizleme teknikleri, sonraki üç boyutlu (3-b) görüntüleme için bir örnek boyunca refraktif indeks dengelenmiş doku şeffaf hale. Makroskopik mesafelere uzanan mikroskobik çok hücreli yapıları analiz etme potansiyeli için tüm araştırma alanlarında büyük önem aldılar. Böbrek tübülleri, damar, sinirler ve glomerüller, sadece kısmen geleneksel iki boyutlu teknikler tarafından şimdiye kadar yakalanan birçok yönde, uzatmak göz önüne alındığında, doku Temizleme de böbrek araştırma birçok yeni alanlar açtı. Optik temizleme yöntemlerinin listesi hızla büyüyor, ancak bu alandaki yeni başlayanlar için belirli bir araştırma sorusu için en iyi yöntemi seçmek zor kalır. Burada sağlanan kalın fare böbrek dilimleri antikor etiketleme birleştiren basit bir yöntemdir; ucuz, toksik olmayan ve kullanıma hazır kimyasal etil cinnamate ile optik temizleme; ve Konfokal görüntüleme. Bu protokol, böbrekler perfkullanmak ve özel ekipman gerektirmeden antikor bağlama artırmak için bir antijen alma adımı kullanın açıklamaktadır. Onun uygulama böbrek içinde görüntüleme farklı çok hücreli yapıları sunulmaktadır, ve nasıl doku içine zayıf antikor penetrasyon sorunlarını gidermek için ele alınmıştır. Ayrıca endojen fluorophores görüntüleme ve çok büyük numuneler edinme ve onları aşmak için potansiyel zorlukları tartışıyoruz. Bu basit protokol, üç boyutta doku çalışması için kolay kurulum ve kapsamlı bir araç sağlar.

Introduction

Tüm organlar veya büyük çok hücreli yapıların incelenmesi artan ilgi üç boyutta şeffaf doku görüntüleme içeren optik temizleme yöntemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Yakın zamana kadar, tüm yapıların hücre numarasını, uzunluğunu veya hacmini tahmin etmek için en iyi yöntemler stereoloji veya kapsamlı seri bölümlendirme olmuştur, bu iki boyutta sonraki analiz için doku sistemik örnekleme dayanmaktadır1, 2 , 3. ancak, bu yöntemler zaman alıcı ve eğitim ve uzmanlık yüksek düzeyde gerekir4. Optik temizleme yöntemleri, 3-b görüntüleme5,6,7için doku yarı saydam yapmak için bir örnek boyunca refraktif indeks dengelenerek bu sorunların üstesinden.

İki ana kategoriye düşen çeşitli optik temizleme yöntemleri geliştirilmiştir: solvent bazlı ve sulu bazlı Yöntemler. Sulu-tabanlı yöntemler daha basit daldırma8,9, hiperhidrasyon10,11ve hidrojel gömme12,13bölünebilir. Solvent bazlı Yöntemler dokusu susuz bırakmak, lipidleri kaldırmak ve 1,55 civarında bir değere refraktif indeksleri normalleştirmek. Çoğu solvent bazlı yöntemin sınırlamaları, GFP, solvent toksisitesi, bazı görüntüleme odalarında veya objektif lenslerde kullanılan yapıştırmaları çözünme kapasitesine sahip yaygın olarak kullanılan muhabir proteinlerinin endojen floresans ve dehidrasyon14,15,16,17,18,19,20,21. Ancak, solvent tabanlı Yöntemler, basit, zaman verimli ve farklı doku türleri bir dizi çalışabilir.

Sulu tabanlı Yöntemler, 1,38-1.52 aralığında refraktif endeksleri olan sulu çözümlerde dokusunun daldırma güveniyor8,11,12,22,23,24 . Bu yöntemler endojen floresan muhabiri protein emisyonunu korumak ve dehidrasyon kaynaklı daralma önlemek için geliştirilmiştir, ancak en sulu bazlı Temizleme yöntemlerinin sınırlamaları protokolün daha uzun bir süre içerir, doku genişleme, ve protein modifikasyon (örneğin SCALea2 gibi hiperhidrasyon protokollerinde üretan proteinleri kısmi denatürasyon)7,11,23,25. SCALe, üre kaynaklı doku genişlemesinin dehidrasyon ile dengelenmesi ve elektron mikroskobu10ile değerlendirildiği gibi doku ultrastrasyonu korunmuş olan Ürea ile Sorbitol ile birleştirerek doku genişlemesini ele aldı. Doku daralma veya genişleme yapıların mutlak boyutlarını, nesneler arasındaki mesafeleri veya hacim başına hücre yoğunluğunu etkiler; Böylece, doku temizlendiğinde boyut değişikliklerinin ölçülmesi elde edilen sonuçların yorumlanmasından7,26‘ ya yardımcı olabilir.

Genel olarak, optik temizleme için bir protokol, ön tedavi, geçirgen, immünolabeling (gerekirse), refraktif indeksleme ve gelişmiş ışık mikroskobu ile görüntüleme (örn. iki foton, konfoköz veya Floresan mikroskopisi). Temizleme yaklaşımlarının çoğu nöronal dokusu görselleştirmek için geliştirilmiştir, ve gelişmekte olan çalışmalar diğer organlarda uygulama doğruluyor5. Bu kapsamlı araç daha önce glomerül27,28, bağışıklık infiltratlar28, damarsal28ve tübül segmentleri dahil olmak üzere böbrek yapıları, güvenilir ve verimli analiz izin göstermiştir 29, ve glomerüler fonksiyon ve sağlık ve hastalık tübül remodeling daha iyi anlayış için ideal bir yaklaşımdır.

Burada özetlenen burada böbrek tübüllerin immünostonluk birleştiren bir solvent tabanlı yöntemdir; ucuz, toksik olmayan ve kullanıma hazır kimyasal etil sinamat (ECI) ile optik temizleme; ve tam tübül görselleştirme ve quantification sağlayan Konfokal mikroskobik görüntüleme. Bu yöntem basittir, antijen-alma böbrek dilimleri ticari antikorların boyama ile birleştirir ve en laboratuvarları için erişilebilir kılan özel ekipman gerektirmez.

Protocol

Not: Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi, Portland, Oregon, ABD ve Almanya ‘nın Aachen kentinde ilgili yerel makamların kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır. 1. retrograd abdominal aort perfüzyon ve fare böbrekleri Fikrasyonu Çözümleri aynı gün veya akşam önce hazırlayın ve bir gecede bir buzdolabında saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına (RT) s?…

Representative Results

Böbrek 43 farklı hücre tipleri31oluşan karmaşık organlar vardır. Bu hücrelerin çoğu glomerül ve tübüller gibi büyük çok hücreli yapıları oluşturur ve fonksiyonları birbirleri ile etkileşimlere son derece bağımlıdır. Klasik 2-D histolojik teknikler, bu büyük yapıları kısmen yakalar ve bozulmamış yapıların içinde odak değişikliklerini kaçırabilir31. Bu nedenle, optik temizleme tekniklerini kullanan 3-b analizi, sağlık ve hastalıklard…

Discussion

Optik temizleme teknikleri, 3-b görselleştirme ve çeşitli organlarda mikroanatomisinin ölçülmesi için geniş önem almıştır. Burada, solvent bazlı Temizleme Yöntemi (ECI) böbrek dilimleri içinde tüm tübüllerin 3-b görüntüleme için immünolabeling ile birleştirilir. Bu yöntem, basit, ucuz ve hızlı. Ancak, diğer araştırma soruları en iyi diğer temizleme protokolleri ile cevap olabilir5. Aynı zamanda solvent tabanlı yöntemlerin değişken derecelerde doku-küçülme …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

T. S. DFG Alman Araştırma Vakfı (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) ve RWTH Aachen Tıp Fakültesi (RWTH Returner programı) gelen hibe tarafından desteklenmektedir. V. G. P. Deutsche Gesellschaft kürk Nefrologie, Alexander von Humboldt Vakfı ve Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıp Araştırma Konseyi araştırma Burslar tarafından desteklenmektedir. D. H. E, Fondation LeDucq tarafından desteklenmektedir. R. K. DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) devleti ve RWTH Aachen Üniversitesi ‘nde klinik araştırmalar için disiplinlerarası Merkezi (O3-11) ‘ den hibe tarafından desteklenmektedir.

Materials

0.22 µm filter Fisher Scientific 09-761-112
15 mL conical tube Fisher Scientific 339650
21 gauge butterfly needle Braun Venofix
3-way stopcock Fisher Scientific K420163-4503
3D analyis software Bitplane AG IMARIS
3D analyis software Cellprofiler free open-source software
5-0 silk suture Fine Science Tools 18020-50
50 ml plastic syringes Fisher Scientific 14-817-57
Anti-BrdU monoclonal antibody Roche 11296736001
Antibody diluent Dako S0809
CD31-647 BioLegend 102516
Citrate-based antigen retrieval solution Vector Laboratories H-3300
curved hemostat Fisher Scientific 13-812-14
Dako Wash Buffer Agilent S3006
dissecting microscope Motic DSK-500
Embedding cassettes Carl Roth E478.1
Ethanol Merck 100983
Ethyl cinnamate Sigma-Aldrich 112372
Flexible film/Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Goat anti-AQP2 Santa Cruz Biotechnology sc-9882
Guinea pig anti-NKCC2 N/A N/A DOI: 10.1681/ASN.2012040404
HCl Carl Roth P074.1
Heparin Sagent Pharmaceuticals 401-02
hemostat Agnthos 312-471-140
horizontal rocker Labnet S2035-E
Imaging dish Ibidi 81218
Ketamine MWI Animal Health 501090
Micro serrefine Fine Science Tools 18052-03
NaOH Fisher Scientific S318-500
Operating scissors Merit 97-272
Paraformaldehyde Thermo Fischer Scientific O4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCC PhosphoSolutions p1311-53
Silicone elastomer World Precision Instruments Kwik-Sil KWIK-SIL
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Tissue slicer Zivic Instruments HSRA001-1
Triton X-100 Acros Organics AC215682500
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-00
Vibratome Lancer Series 1000
Xylazine MWI Animal Health AnaSed Inj SA (Xylazine)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).

Tags

3D ImagingImmunolabelingOptical ClearingAntibody LabelingAntigen Retrieval3D VisualizationMulti-cellular Structures
check_url/fr/60002?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue. J. Vis. Exp. (149), e60002, doi:10.3791/60002 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image