Характеристика Мембранных Транспортеров по гетерологусному выражению в кишечной палочке и производству Мембранных Весиклей

Summary

Мы описываем метод характеристики протонных мембранных переносчиков в мембранных препаратов везикулы, производимых гетерологическим выражением в кишечной палочке и лизисклетов с помощью французской прессы.

Abstract

Было разработано несколько методов функциональной характеристики новых мембранных транспортеров. Полиамины широко распространены во всех организмах, но полиаминовые обменники в растениях не были выявлены. Здесь мы намечаем метод характеристики полиаминов антипортеров с использованием мембранных пузырьков, полученных из лизиса клеток кишечной палочки, гетеролологически выражающих растительный антипорт. Во-первых, мы heterologously выразили AtBAT1 в штамме кишечной палочки, дефиците полиамина и аргинина обмен транспортеров. Vesicles были произведены с использованием французской прессы, очищены от ультрацентрифугации и использованы в мембранной фильтрации проверки помечены субстратов, чтобы продемонстрировать специфику субстрата транспортера. Эти анализы показали, что AtBAT1 является протонным транспортером аргинина, а-аминомасляной кислоты (ГАМК), путрешкина и спермидина. Штамм мутантов, разработанный для анализа AtBAT1, может быть полезен для функционального анализа других семейств обменников полиамина растений и животных. Мы также предполагаем, что этот подход может быть использован для характеристики многих других типов антипортеров, до тех пор, как эти белки могут быть выражены в мембране бактериальных клеток. E. coli является хорошей системой для характеристики новых транспортеров, так как существует несколько методов, которые могут быть использованы для мутации местных транспортеров.

Introduction

Белки, участвующие в торговле метаболитами, представляют собой необходимый уровень физиологической регуляции, однако подавляющее большинство переносчиков растительных мембран еще не были функционально охарактеризованы. Было реализовано несколько стратегий, характеризующих новые транспортные белки. Гетерологические выражения в модельных организмах, таких как кишечная палочка и эукариотические клетки, такие как дрожжи, ксенопусские яйцеклетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых и растительные клетки, все были использованы для определения их транспортной активности¹. Эукариотические клетки благоприятствуют экспрессии эукариотических белков, потому что основной клеточный состав, пути преображения сигнала, транскрипция и перевод машины совместимы с родными условиями.

Дрожжи были важной моделью организма для характеристики новых транспортных белков в растениях. Первый растительный транспортный белок, который был успешно выражен в дрожжах(Saccharomyces pombe) был гексозный транспортер HUP1 от Chlorella². С тех пор многие растительные переносные белки были функционально охарактеризованы с помощью системы экспрессии дрожжей. К ним относятся, транспортеры сахара растений (SUC1 и SUC2³, VfSUT1 и VfSTP1⁴) и auxin транспортеры (AUX1 и PIN⁵). Недостатки использования дрожжей для экспресс-белков растений могут включать в себя нарушение активности пластид-локализованных белков, потому что дрожжи не хватает этой органеллы, mistargeting⁶, и формирование неправильно сложить агрегаты и активации реакции напряжения в дрожжах из-за переэкспрессии мембранных белков^7,8,9.

Гетерологические выражения транспортных белков в оновых яйцеклетках Ксенопуса широко использовались для электрофизиологической характеристики транспортеров^10. Первые растительные транспортные белки, характеризуемые с использованием гетерологических выражений в ооцитах Xenopus, были каналом arabidopsis калий KAT1¹⁰ и арабидопсисом гексоза транспортер STP1¹¹. С тех пор, Ксенопус ооциты были использованы для характеристики многих растительных транспортных белков, таких как плазменные мембраны транспортеров¹², вакуолярной сахарозы транспортер SUT4¹³ и вакуолярный malate транспортер ALMT9¹⁴. Важным ограничением ксенопусных яйцеклеток для транспортных анализов является то, что концентрацией внутриклеточных метаболитов нельзя манипулировать^1. Кроме того, профессиональные знания необходимы для подготовки ооцитов Ксенопуса и изменчивость партий яйцеклеток трудно контролировать.

Гетерологические выражения в модельном организме E. coli является идеальной системой с точки зрения характеристики новых растительных транспортных белков. С полностью секвенированным геномом¹⁵, молекулярные и физиологические характеристики кишечной палочки хорошо известны. Молекулярные инструменты и методы хорошо созданы¹⁶. Кроме того, различные векторы экспрессии, непатогенные штаммы и мутанты доступны^17,18,19. Кроме того, кишечная палочка имеет высокие темпы роста и может быть легко выращивается в лабораторных условиях. Многие белки могут быть легко выражены и очищены в больших количествах в E. coli^9. Когда белки не могут быть асссированы непосредственно в клеточных системах, восстановление белков в липосомы также было успешным, хотя и сложным нововведением для характеристики очищенных мембранных белков. Функциональная характеристика растительных митохондриальных транспортных белков, включая растворимые транспортеры, такие как фосфатные транспортеры в сое, кукурузе, рисе и арабидопсисе, dicarboxylate-tricarboxylate перевозчика в Arabidopsis были выполнены с помощью этой модели системы^20,21. Тем не менее, рекомбинантные белки томатного белка SICAT9 были признаны нефункциональными в экспериментах по восстановлению, а другие члены семейства транспортер CAT были признаны нефункциональными в анализе ооцитов Xenopus ^22. Таким образом, необходимы дополнительные молекулярные инструменты для характеристики мембранных транспортеров.

Пять полиаминов транспортных систем находятся в E. coli²³. Они включают в себя два abc транспортеров посредничество поглощения спермидин и putrescine, putrescine / орнитин обменник, кадаверин / лизин обменник, спермидин экспортера и putrescine импортера. Putrescine обменник PotE был первоначально охарактеризован с помощью везикулы асссея, где наизнанку пузырьков были подготовлены лизинг клетки с французской прессой и измерения поглощения радиомаркированных putrescine в пузырьки в обмен на орнитин²⁴. Vesicle анализы были также использованы для характеристики транспортера кальция, который опосредовал транспортировку кальция в ответ на градиент протона²⁵. Эти эксперименты побудили нас разработать стратегию характеристики других обменников полиамина. Сначала мы создали штамм E. coli дефицит в PotE и CadB обменников. Здесь мы демонстрируем функциональную характеристику растительного полиаминового антипорта гетерологическим выражением в модифицированном штамме кишечной палочки, генерации мембранных пузырьков с использованием французской прессы и радиомаркированных анализов.

Protocol

1. Поколение E. coli Двойной knock Out мутант с P1 Трансдукция Получить E. coli одного нокаута мутант штаммов »PotE и »CadB от E. coli генетический фондовый центр(http://cgsc.biology.yale.edu).ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм «PotE» является канамицин устойч?…

Representative Results

Основные шаги в этом протоколе обобщены живописно на рисунке 1. Короче говоря, клетки кишечной палочки, недостающие во всех обменных пунктах полиамина и выражающие AtBAT1, культивируются, центрифугируются, промываются буфером и подвергаются кле…

Discussion

В настоящем исследовании мы излагаем метод характеристики антипорта, сначала выражая белок в кишечной палочке, а затем генерируя мембранные пузырьки, так что гетеролоязычно выраженный белок может быть прослежен в системе, свободной от клеток. В дополнение к оборудованию, найденн?…

Materials

2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
3H-putrescine	PerkinElmer	NET185001MC
3H-spermidine	PerkinElmer	NET522001MC
4-chloro-1-naphthol	Sigma-Aldrich	C8890
14C arginine	Moravek Inc.	MC137
Arginine	Sigma-Aldrich	A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody	ThermoFisher	R931-25	Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
BCA protein assay kit	ThermoFisher	23227	Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue	Bio-Rad	161-0404
Carboxypeptidase B	Sigma-Aldrich	C9584-1mg
Centrifuge	Sorvall		SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder	LabGenome	7777-7	Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	scintillation cocktail
EDTA	Sigma-Aldrich
Filtration manifold	Hoefer	FH225V
French Pressure Cell	Glen Mills	FA-080A120
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Glutamate	Sigma-Aldrich	G6904
Glycerol
GraphPad Prism software			http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide	KROGER
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Liquid scintillation counter	Beckman	LS-6500
Maleate	Sigma-Aldrich	M0375
Nanodrop	ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters	Merck Millipore	hawp02500	0.45 µM
PCR clean up kit	Genscript		QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic	ThermoFisher	P290-500
putrescine	fluka	32810
Potassium Phosphate monobasic	J.T.Baker	4008
Spermidine	Sigma-aldrich	S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10	This manuscript	Available upon request.	Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base	Research Products	T60040-1000
Ultracentrifuge	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes	ThermoFisher	45237	Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49	ThermoFisher		Gateway expression vector for E. coli