معالجة الجنين، قشر البيض، والثقافة الفطرية لمسح المجهر الإلكتروني
Summary
هنا، نقدم بروتوكولات معالجة مفصلة لتصوير عينات الأنسجة الحساسة باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني (SEM). وهناك ثلاث طرق معالجة مختلفة، وهي التجفيف الكيميائي لسداسي ميثيل ديسيلازانا (HMDS)، وتجفيف الهواء البسيط، وتجفيف النقاط الحرجة، ووصفها لإعداد قشر البيض الصلب، والأجنة في مراحل النمو المبكرة، والثقافات الفطرية على التوالي.
Abstract
وعلى الرغم من أن الفحص المجهري للإلكترون (SEM) يستخدم على نطاق واسع لإجراء تحليل هيكلي فائق لمختلف العينات البيولوجية وغير البيولوجية، فإن الأساليب التي تنطوي عليها معالجة العينات البيولوجية المختلفة تنطوي على ممارسات فريدة من نوعها. جميع الممارسات التقليدية الموصوفة في المؤلفات لمعالجة العينات لا تزال تجد تطبيقات مفيدة، ولكن التغييرات الدقيقة في إعداد العينة يمكن أن تغير جودة الصورة، وكذلك، إدخال القطع الأثرية. وبالتالي، فإن استخدام تقنية إعداد عينة فريدة من نوعها محددة لنوع الأنسجة التي تم تحليلها مطلوب للحصول على صورة ذات نوعية جيدة مع دقة فائقة الهيكلية. تركز هذه الدراسة على توفير بروتوكولات إعداد العينات المثلى لتصوير الأجنة، والأصداف البيض الصلبة، والثقافات الفطرية باستخدام SEM. وقد أوصي تُوصِّل التحسينات التالية لتحقيق نتائج جيدة للعينات البيولوجية الحساسة الثلاث المختلفة التي تمت دراستها. استخدام المثبتات أكثر اعتدالا مثل 4٪ بارافورمالدهايد أو 3٪ الجلوتالالديهايد تليها الجفاف مع سلسلة الإيثانول إلزامي. الميسليوم الفطري على كتل أجار التي تم الحصول عليها من قبل الثقافات الشريحة تسفر عن سلامة أفضل فائقة الهيكلية بالمقارنة مع الثقافات التي اتخذت مباشرة من لوحات أجار. التجفيف الكيميائي للأجنة مع HMDS يوفر التجفيف دون إدخال القطع الأثرية التوتر السطحي مقارنة مع التجفيف نقطة حرجة. HMDS يمنع تكسير الناجمة عن انكماش كما عينات أقل هشاشة أثناء التجفيف. ومع ذلك، للثقافة الفطرية، التجفيف نقطة حرجة يوفر جودة صورة مقبولة بالمقارنة مع التجفيف الكيميائي. يمكن تصوير قشر البيض مع عدم وجود خطوات إعداد خاصة باستثناء الغسيل الدقيق وتجفيف الهواء قبل التركيب. وتم توحيد منهجيات الإعداد على أساس جودة الصورة المقبولة التي تم الحصول عليها مع كل تجربة.
Introduction
المسح المجهر الإلكتروني (SEM) التحليل الهيكلي الفائق والتصوير داخل الخلايا تكملة المجهرية الخفيفة لتوصيف ثلاثي الأبعاد من prokaryotes والنباتات والحيوانات. الاستبانة المكانية العالية لSEM يجعلها واحدة من أكثر التقنيات تنوعا وقوة المتاحة لفحص الخصائص الميكروالهيكلية للعينات في مقياس نانومتر إلى مقياس ميكرومتر. يتم حل العينات المجففة إلى الهياكل التركيبية والطوبوغرافية مع التفاصيل المكثفة، والتيتوفر الأساس لوضع استنتاجات صحيحة حول العلاقات الوظيفية 1،2،3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.عند تفسير الصور SEM من العينات البيولوجية، فإنه من التحدي الكبير للتمييز بين الهياكل الأصلية والقطع الأثرية التي يتم إنشاؤها أثناء المعالجة. يتم تشغيل SEM عموما في فراغات عالية جدا لتجنب أي تدخل من جزيئات الغاز التي تؤثر على الحزم الإلكترونية الأولية أو الثانوية أو المتناثرة من العينة10،11. كما أن المواد البيولوجية معرضة للتلف الإشعاعي بسبب خصائصها السيئة أو غير المنضوية. فمن الضروري للعينات المحملة في SEM أن تكون جافة تماما وخالية من أي ملوثات عضوية للقضاء على أي outgassing ممكن في بيئة فراغ عالية10،11. وبما أن العينات البيولوجية تتألف في معظمها من الماء، فإن هناك حاجة إلى تقنيات وقائية إضافية لضمان الاحتفاظ بالهياكل الأصلية.
ويستند القرار الذي تم الحصول عليه إلى تحسين أساليب الإعداد الخاصة بأنواع العينات والمعلمات الآلية المستخدمة. وبالتالي، فمن الضروري تجنب استخدام خطوات المعالجة المعممة لجميع أنواع الأنسجة. وستحتاج بعض العينات البيولوجية إلى معالجة أقل صرامة للحفاظ على هيكلها، في حين قد يلزم مزيد من الوقت والرعاية لأنواع دقيقة من العينات لتجنب إدخال قطع التجفيف، مثل الانكماش والانهيار. إعداد العينة هو خطوة حاسمة في التصوير SEM; نتائج الدراسات المورفومترية تتأثر بشكل ملحوظ بإجراءات إعداد العينات12،13. خطوات التحضير الشائعة للعديد من العينات البيولوجية هي التثبيت والجفاف والطلاء مع معدن مثل الذهب أو البلاتين أو البلاديوم لتحويل أسطحها لتكون موصلة لتحليل SEM. وتختلف طبيعة الخطوات المستخدمة ومزيجها حسب نوع الأنسجة والأهداف المحددة للدراسة. زيادة تهمة، والحساسية للفراغ والضرر شعاع الإلكترون تشكل مشاكل عند معالجة عينات البيولوجية الحساسة لينة، مما يتطلب خطوات معالجة إضافية للحفاظ على الهيكل الأصلي للكائن. استخدام الأساليب التقليدية مثل تحديد تتروكسيد أوزميوم، والجفاف يسبب انكماش وانهيار الأنسجة الحساسة14،15،16،17. والهدف من الدراسة هو وضع منهجيات أنيقة مستمدة من الجمع بين الأفكار من الدراسات السابقة مع التعديلات لإعداد وصورة الأنسجة الحساسة الناعمة (على سبيل المثال، أجنة الزواحف، قشر البيض من السلاحف المطلية، والثقافات الفطرية).
اختيار طريقة تحديد مناسبة هي الخطوة الأولى الأكثر أهمية للتحليل المجهري للعينات البيولوجية. إصلاح الأنسجة مباشرة بعد عزل من كائن حي أمر ضروري لمنع التغيير في مورفولوجيا بسبب التحلل. يجب على المثبت الفعال إنهاء العمليات الخلوية عن طريق permeating الخلايا بسرعة والحفاظ على تأثير لا رجعة فيه لتحقيق الاستقرار في هيكل العينة لتحمل كل من خطوات المعالجة اللاحقة والفحص تحت SEM17 , 18.على الرغم من أن العديد من أساليب التثبيت الكيميائي والفيزيائي معروفة، والتثبيت الكيميائي هو أكثر شيوعا للعينات البيولوجية لتجنب أي تغييرات الخلوية بسبب الانهاليس التلقائي، وتعفن، وآثار التجفيف. هناك العديد من التركيبات الكيميائية المثبتة التي نوقشت في الأدب17،19،20،21،22،23،المثبتات التي تعمل عن طريق denaturing و تخثر الجزيئات البيولوجية، وتلك التي تصلح من خلال الجزيئات الكبيرة عبر التشابك بشكل مشترك. وتستخدم المشروبات الكحولية كالمثبتات denaturing التي تحافظ على البنية الفائقة سيئة جدا وتستخدم في الغالب للميكروسكوب الخفيفة ولا ينصح لتحليل مجهري الإلكترون. المثبتات عبر ربط مثل الفورمالديهايد، الجلوتارهايد، وأوستروكسيد الأوميوم خلق الترابط بين الجزيئية وداخل الجزيئية بين الجزيئات الكبيرة داخل الأنسجة، وتوفير الحفاظ ممتازة من الهياكل الفائقة11 ،24،25،26. العينات البيولوجية حساسة لدرجة الحرارة. ينصح درجة الحرارة في بداية التثبيت أن تكون 4 درجة مئوية للحد من الحركة الجانبية للبروتينات الغشاء، لإبطاء انتشار الجزيئات بين الخلايا، وإبطاء معدل التثبيت11. الوقت اللازم لإصلاح الأنسجة يعتمد إلى حد كبير على حجم العينة والسرعة التي ينتشر المثبت ويتفاعل مع مكونات العينة. تثبيت بين عشية وضحاها في 4٪ paraformaldehyde أو 3٪ الجلوتالالديهايد في PBS في 4 درجة مئوية هو الأسلوب المفضل لتحليل SEM من العينات المستخدمة في هذه الدراسة لخصائصها اختراقية متسلسلة، والتي تسمح عينات حساسة أصغر ليتم معالجتها17 , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 27-وزيدت خطوة ما بعد التثبيت مع تتزاز الأوميوم ليس فقط بسبب طبيعته السامة ولكن أيضاً تبين أنه لا يطبق أي ميزة إضافية لتحسين جودة الصورة للعينات التي تم تحليلها في هذه الدراسة.
تحتوي العينات البيولوجية على سوائل تتداخل مع عملية SEM؛ وبالتالي، فإن العينات تحتاج إلى أن تجفف قبل إدراجه في غرفة عينة SEM. بمجرد ضمان الجفاف، يجب إزالة المذيب من الأنسجة دون إنشاء القطع الأثرية في العينات بسبب التوتر السطحي / التجفيف. وكانت هناك ثلاث طرق تجفيف مختلفة تستخدم عادة أثناء معالجة الأنسجة لتصوير SEM: تجفيف الهواء، وتجفيف نقطة حرجة، وتجميد عينات التجفيف28،29،30،31. عدد قليل من الدراسات تقرير جميع أساليب التجفيف الثلاثة التي تنتج نتائج متطابقة مع عينات الأنسجة الحيوانية28،29،30،31. ومن الممارسات العامة المستخدمة في العينات الصغيرة الجفاف الكيميائي عن طريق سلسلة تركيز تصاعدية من الكحول وسداسي ميثيل الديسيلازان (HMDS)، ولكن يتم تجفيف عينات أكبر باستخدام أداة تجفيف نقطة حرجة (CPD)32. خلال عملية التجفيف، شكلت قوى كبيرة في تجاويف صغيرة التي يتم تمريرها من خلال العينة عن طريق واجهة السائل / الغاز؛ هذا يمكن أن يؤدي حتى إلى انهيار كامل للهياكل جوفاء33. ويمكن عندئذ أن يخطئ أي تشوه يحدث بسبب العلاج كسمة هيكلية أصلية للعينة. وبالتالي، ينبغي القضاء على الظاهرة المعممة للمعالجة، وينبغي توحيد عملية تجفيف فريدة من نوعها لكل نوع من الأنسجة خاصة عندما يتم تحليل عينات الأنسجة الحساسة.
في العديد من التجارب التي أجريت باستخدام مزيج مختلف من جميع العمليات المذكورة أعلاه، قمنا بتوحيد الأساليب التي يمكن استخدامها لتحليل SEM لثلاثة أنسجة حساسة: أجنة الزواحف، وقذائف البيض من السلاحف المرسومة، والثقافات الفطرية. يصف علماء الأحياء التنموية وعلماء المورفولوجيا التكوين الطبيعي وغير الطبيعي أثناء نمو الأجنة في الحيوانات الفقارية التمثيلية. تعتمد التحقيقات في مسارات الإشارات الجينية على الوصف المورفولوجي للهياكل الجديدة. لتجنب أي تغيير مفاجئ في بنية الأجنة الفقارية أثناء تحليل SEM، نوصي بالتجفيف الكيميائي بعد الجفاف. التجفيف الكيميائي باستخدام HMDS هو أحدث طريقة تجفيف نسبيا وتشمل المزايا السرعة النسبية، وسهولةالاستخدام، وفقدان التكلفة، والخبرة المحدودة والمعدات اللازمة 9. CPD هو تقنية التجفيف شائعة الاستخدام باستخدام تمرير ثاني أكسيد الكربون2 عبر العينات في درجة حرارة والضغط محددة. لقد حددنا أن HMDS مناسب لتجفيف الأنسجة الحساسة الناعمة ويسمح بمعالجة عينات أكبر مقارنة بتجفيف النقاط الحرجة، مما تسبب في تشوه واسع النطاق للأنسجة الجنينية. وقد استخدمت عدة طرق لإعداد عينات لتصوير SEM لدراسة الخصائص المورفولوجية للفطريات34. يتم إصلاح العينات الفطرية عادة في تتزاز أوزميوم تليها جفاف الإيثانول وتجفيف نقطة حرجة، والتي قد توفر نتائج مرضية، على الرغم من أن الآثار السامة لأكسيد الأوساميوم6و7و35 وفقدان المواد الفطرية أثناء تغيير الحلول أثناء المعالجة هي عيوب واضحة. كما تم ممارسة تقنية إعداد العينات باستخدام تجفيف الهواء دون تثبيت36 ولكن النتائج في هياكل تقلصت ومطوية، ومراقبة مثل هذه العينات يمكن بسهولة أن يساء تفسيرها مع تميز الأنواع. الهيفا الفطرية يفقد سلامتها في الاتصال مع السوائل وحتى التجفيف قد لا يتحقق لاستعادة الهيكل. ونتيجة لهذا الغرض، يستخدم تجميد التجفيف عادة لتجفيف الأنسجة الرخوة مثل الميسليوم الفطري. تجميد التجفيف يعمل بشكل جيد للمواد النظيفة ولكن وجود أي أملاح أو إفراز سوف تحجب التفاصيل السطحية التي سيتم تحديدها فقط في مرحلة مشاهدة SEM. نحن جنبا إلى جنب مع طريقة ثقافة الشريحة مع إصلاح الجلوتارهايد والتجفيف نقطة حرجة لإنتاج التفاصيل الهيكلية من الهيبهاي الفطرية سليمة والجراثيم. على الرغم من أن تجفيف CPD تسبب انكماش في الأجنة، أدى إلى هياكل مسيليال الحفاظ عليها بشكل جيد عندما يقترن تثبيت الجلوتالالديهايد. قشر البيض هو من الأهمية بمكان لجنين الحيوانات oviparous ليس فقط من خلال العمل كغطاء وقائي ولكن أيضا توفير الاستقرار الميكانيكي، نفاذية للغاز والماء، واحتياطي الكالسيوم للجنين النامية. وتصنف قشرة بيض السلاحف في المياه العذبة على أنها “جامدة” علىأساس هيكلها، ونظرا لتوافرها قد تلقت اهتماما كبيرا من علماء الأحياء 1،2،3،4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
نحن بالتفصيل طرق بسيطة لسهولة فحص قشر البيض وأغشية قذيفة من السلاحف المطلية التي يمكن تطبيقها على أي أنواع قشر البيض جامدة. وتم تقييم منهجيات الإعداد على أساس جودة الصورة الناتجة عن ذلك وانخفاض القطع الأثرية المحتملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في دراستنا، تم اختبار عوامل التثبيت المختلفة، وطرق الجفاف والتجفيف لإعداد ثلاث عينات بيولوجية حساسة مختلفة لتصوير SEM: الأجنة، قشر البيض، والثقافات الفطرية. يستخدم SEM عادة لتحليل السطح، لذلك الاختراق المثبت هو أقل فيما يتعلق، ولكن يجب أن يكون مفهوما أن الهياكل الداخلية الثابتة سيئة سوف يس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور دانيال بالداسار، سوني أوسووغو على المناقشات والتعليقات المفيدة على المخطوطة. وقد حظيت هذه الدراسة بدعم من منح رايس كريك المنتسبة، أوغويغو؛ منح التحدي سوني أوسويوغو والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) المنح الصغيرة إلى PGL وJG.
Materials
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. . Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. . Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. . Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , (2000).
- Hayat, M. A. . Fixation for electron microscopy. , (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O’Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate “Gymnodinioid” Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
