Bearbetning embryo, äggskal, och svamp kultur för scanning elektronmikroskopi

Summary

Här presenterar vi detaljerade bearbetnings protokoll för avbildning av känsliga vävnadsprov med hjälp av scanningelektronmikroskopi (SEM). Tre olika bearbetningsmetoder, nämligen, hexametyldisilazana (HMDS) kemisk torkning, enkel lufttorkning, och kritisk punkt torkning beskrivs för beredning av styv äggskal, embryon i tidiga utvecklingsstadier, och svamp kulturer respektive.

Abstract

Även om scanning elektronmikroskopi (SEM) används i stor utsträckning för den ultrakonstrukturella analysen av olika biologiska och icke-biologiska prover, innebär metoder involverade i bearbetning av olika biologiska prover unika metoder. Alla konventionella metoder som beskrivs i litteraturen för bearbetning prover fortfarande hitta användbara program, men subtila förändringar i provet preparatet kan förändra bildkvaliteten, samt införa artefakter. Därför, med hjälp av en unik provberedning teknik som är specifika för den typ av vävnad analyseras krävs för att få en god kvalitet bild med ultrastrukturella upplösning. Fokus för denna studie är att ge optimala provberedning protokoll för Imaging embryon, stela äggskal, och svamp kulturer med SEM. Följande optimeringar rekommenderades att ge goda resultat för de tre olika känsliga biologiska prover studeras. Användning av mildare fixeringsmedel som 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd följt av uttorkning med etanol serien är obligatoriskt. Svamp mycel på agar block som erhålls genom bild kulturer ger en bättre ultrastrukturella integritet jämfört med kulturer tagna direkt från agar plattor. Kemisk torkning av embryon med HMDS ger torkning utan att införa ytspännings artefakter jämfört med kritisk punkt torkning. HMDS förhindrar sprickbildning orsakad av krympning eftersom proverna är mindre spröda under torkning. Men för svamp kultur, kritisk punkt torkning ger acceptabel bildkvalitet jämfört med kemisk torkning. Äggskal kan avbildas utan särskild förberedelsesteg förutom grundlig tvättning och lufttorkning före montering. Berednings metoderna standardiserades utifrån godtagbar bildkvalitet som erhållits vid varje försök.

Introduction

Scanning elektronmikroskop (SEM) ultrastrukturell analys och intracellulära Imaging komplettera ljus mikroskopi för tredimensionell profilering av prokaryoter, växter och djur. Den höga rumsliga upplösningen av en SEM gör den till en av de mest mångsidiga och kraftfulla tekniker som finns för undersökning av mikrostrukturella egenskaper hos prover vid nanometer till mikrometerskalan. Desiccated prover är beslutna att kompositionella och topografiska strukturer med intensiv detalj, som ger Stiftelsen för att utveckla giltiga slutsatser om funktionella relationer^{1,2,3 , 4 , ,5 , 6 , 7 , 8 , 9}. vid tolkning av SEM-bilder av biologiska preparat är det en stor utmaning att skilja mellan inhemska strukturer och de artefakter som skapas under bearbetningen. SEM drivs i allmänhet med mycket höga vakuum för att undvika störningar från gasmolekyler som påverkar de primära, sekundära eller bakåtspridda elektronstrålar som avges från provet^10,11. Dessutom är biologiskt material mottagliga för strålningsskador på grund av deras fattiga eller icke-ledande egenskaper. Det är viktigt för de prover som lastas i SEM att vara helt torr och fri från alla organiska föroreningar för att eliminera eventuella outgassing i en högvakuum miljö^10,11. Eftersom biologiska preparat består mestadels av vatten, krävs ytterligare förberedande tekniker för att säkerställa att de inhemska strukturerna bibehålls.

Den erhållna resolutionen bygger på att optimera förberedelse metoder som är specifika för preparat typer och instrumentella parametrar utnyttjas. Därför är det nödvändigt att undvika att använda generaliserade bearbetningssteg för alla vävnadstyper. Vissa biologiska prover kommer att kräva mindre stränga bearbetning för att bevara sin struktur medan mer tid och omsorg kan behövas för känsliga typer av prover för att undvika införandet av torkning artefakter, såsom krympning och kollaps. Provberedning är ett kritiskt steg i SEM Imaging; resultaten av morphometriska studier är anmärkningsvärt påverkade av preparat berednings procedurerna^12,13. Vanliga förberedelsesteg för många biologiska prover är fixering, uttorkning och beläggning med en metall som guld, platina eller Palladium för att omvandla sina ytor för att vara ledande för SEM-analys. Arten och kombinationen av steg som används kommer att variera beroende på vilken typ av vävnad, och de specifika målen för studien. Laddning uppbyggnad, känslighet för vakuum och elektronstråle skador utgör problem vid bearbetning av mjuka känsliga biologiska prover, vilket kräver ytterligare bearbetning steg för att behålla den ursprungliga strukturen av objektet. Använda konventionella metoder som osmium grundämnetetroxide fastställande, och uttorkning orsaka krympning och kollapsen av känsliga vävnader^14,15,16,17. Syftet med studien är att etablera eleganta metoder som bygger på att kombinera idéer från tidigare studier med modifikationer för att förbereda och avbilda mjuka, ömtåliga vävnader (t. ex. reptilembryon, äggskal av målade sköldpaddor och svamp kulturer).

Val av lämplig infästnings metod är det första viktigaste steget för Mikroskopisk analys av biologiska preparat. Fastställande av vävnader omedelbart efter isolering från en organism är viktigt att förhindra förändring i deras morfologi på grund av nedbrytning. En effektiv fixativ bör avsluta cellulära processer genom att tränga igenom cellerna snabbt och bibehålla effekten oåterkalleligt att stabilisera strukturen i provet för att motstå både efterföljande bearbetning steg och undersökning enligt SEM^{17 , 18}. även om flera kemiska och fysiska fixeringsmetoder är kända, är kemisk fixering oftare används för biologiska prover för att undvika eventuella cellulära förändringar på grund av autolys, förruttnelse, och torkning effekter. Det finns många fixativ kemiska formuleringar som diskuteras i litteraturen^{17,19,20,21,22,23}, fixeringsmedel som fungerar genom att denaturera och koagulerar biologiska makromolekyler, och de som fixas av kovalent tvärbindning av makromolekyler. Alkoholer används som denaturerande fixeringsmedel som bevarar ultrastruktur mycket dåligt och används mest för ljusmikroskopi och rekommenderas inte för elektron Mikroskopisk analys. Tvärbindning fästmedel som formaldehyd, glutaraldehyd, och osmium grundämnetetroxide skapa intermolekylär och intramolekylära tvärbindning mellan makromolekyler i vävnaderna, vilket ger utmärkt bevarande av Ultra-strukturer^{11 ,24,25,26}. Biologiska prover är känsliga för temperatur. Temperaturen i början av fixering rekommenderas att vara 4 ° c för att minska den laterala rörligheten för membranproteiner, att bromsa spridningen av intercellulära molekyler, och att bromsa graden av fixering¹¹. Den tid som krävs för att fästa vävnader beror till stor del på provets storlek och den hastighet med vilken fixativ sprider sig och reagerar med komponenterna i preparatet. En övernattning fixering i 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd i PBS vid 4 ° c är den föredragna metoden för SEM analys av prover som används i denna studie för deras sekventiella penetrerande egenskaper, som gör att mindre känsliga prover som skall bearbetas^{17 , 18 , 19 , 20 , 27}. en post-fixering steg med osmium grundämnetetroxide elimineras inte bara på grund av dess giftiga natur utan också funnit att genomföra ingen extra fördel att förbättra bildkvaliteten för de prover som analyseras i denna studie.

Biologiska prover innehåller vätskor som stör SEM-operationen; Proverna måste därför torkas innan de sätts in i SEM-provkammaren. När dehydratisering säkerställs, måste lösningsmedlet avlägsnas från vävnaden utan att skapa artefakter i proverna på grund av ytspänningen/torkning. Tre olika torkmetoder användes vanligen vid bearbetning av vävnader för SEM-avbildning: lufttorkning, kritisk punkt torkning och frys tork prov^28,29,30,31. Få studier rapporterar alla tre torkmetoder som producerar identiska resultat med djurvävnadsprover^28,29,30,31. En allmän praxis som används för mindre exemplar är kemisk uttorkning genom stigande koncentration serie av alkohol och hexamethyldisilazane (HMDS), men större prover torkas med hjälp av en kritisk punkt torkning (CPD) instrument³². Under torkningsprocessen, stora krafter bildas i små hålrum som leds genom provet genom en vätska/gas gränssnitt; Detta kan även leda till en fullständig kollaps av de ihåliga strukturerna³³. Deformationer som uppstår på grund av behandlingen kan då förväxlas med en ursprunglig strukturell egenskap hos preparatet. Således bör det generaliserade fenomenet för bearbetning elimineras och en unik torkprocess bör standardiseras för varje typ av vävnad, särskilt när känsliga vävnadsprov analyseras.

I flera prövningar som utförs med hjälp av olika kombination av alla ovan nämnda processer, standardiserade vi de metoder som kan användas för SEM analys av tre känsliga vävnader: reptil embryon, äggskal av målade sköldpaddor och svamp kulturer. Utvecklingbiologer och morfologer beskriver normala och onormala morfogenes under embryots utveckling hos representativa ryggradsdjur. Utredningar om gen signalvägar beror på den morfologiska beskrivningen av nya strukturer. För att undvika plötsliga förändringar av ryggradsdjur embryot under SEM-analys, rekommenderar vi kemisk torkning efter uttorkning. Kemisk torkning med HMDS är den relativt nyaste tork metoden och fördelarna inkluderar relativ snabbhet, användarvänlighet, förlorad kostnad, och den begränsade expertis och utrustning som behövs⁹. CPD är en vanligt förekommande torkteknik med hjälp av passaging CO₂ över proverna vid en viss temperatur och tryck. Vi identifierade att HMDS är lämplig för torkning av mjuka känsliga vävnader och tillåter större prover som skall bearbetas jämfört med kritisk punkt torkning, vilket orsakade omfattande deformation till embryonala vävnader. Flera metoder har använts för att förbereda prover för SEM Imaging att studera de morfologiska egenskaperna hos svampar³⁴. Svampprover är vanligen fasta i osmium tetroxid följt av etanol uttorkning och kritisk punkt torkning, som kan ge tillfredsställande resultat, även om de toxiska effekterna av osmium grundämnetetroxide^6,7,35 och förlora svamp material medan föränderliga lösningar under bearbetningen är uttalade nackdelar. Provet beredning teknik med hjälp av lufttorkning utan fixering har också praktiserats³⁶ men resulterar i krympta och kollapsade strukturer, och observation av sådana prover kan lätt misstolkas medan karakterisera arten. Svamp hypha förlorar sin integritet i kontakt med vätskor och en jämn torkning kan inte uppnås för att återställa strukturen. På grund av denna effekt, frystorkning används ofta för torkning av mjuka vävnader som svamp mycel. Frystorkning fungerar bra för rena material men närvaron av eventuella salter eller sekretion kommer att skymma ytan detalj som kommer att identifieras endast på SEM visning skede. Vi kopplade bild kulturen metoden med glutaraldehyd fastställande och kritisk punkt torkning för att ge strukturella detaljer i intakt svamp hyfer och sporer. Även om CPD torkning orsakade krympning hos embryon, det resulterade i väl bevarade Mycelial strukturer när den kombineras med glutaraldehydfixering. Äggskal är av primär betydelse för embryot till oviparous djur genom att inte bara fungera som en skyddande beläggning utan också att ge mekanisk stabilitet, permeabilitet för gas och vatten, och en kalcium reserv för att utveckla embryot. Sötvatten sköldpadda äggskal klassificeras som “stela” baserat på deras struktur, och på grund av deras tillgänglighet har fått betydande uppmärksamhet från biologer^{1,2,3,4 , ,5 , 6 , 7 , 37 , 38}.

Vi detalj enkla metoder för enkel undersökning av äggskal och skal membran av målade sköldpadda som kan tillämpas på alla stela äggskal arter. Beredningsmetoder utvärderades baserat på resulterande bildkvalitet och minskad potentiella artefakter.

Protocol

Obs: målade sköldpadda (Chrysemys picta) ägg som används i denna studie samlades under häckningsperioden maj till juni 2015-16 från Rice Creek Field Station, Oswego New York med tillstånd från New York State Department of Environmental Bevarande (DEC). 1. kemisk torkmetod för att bearbeta embryon för SEM Samla sköldpadda ägg från fält platser under häckningssäsongen. Förbered inkuberingskamrarna i förväg, gjorda av plastlådor med lock (L x b x H) 6,7 cm x…

Representative Results

Figur 1 Visa skanning elektron Mikrografisk analys av målade sköldpadda (Chrysemys picta) embryon. Målade sköldpadda ägg samlas in och inkuberas på ett strö medium, monterad på aluminium-stubbar efter kemisk torkning användes för SEM-avbildning (figur 1a-E). En lateral bild av en etapp 12 embryo visar kraniofacial strukturer; maxillary framträdande sträcker sig bortom mandibular och begränsar en väl markerad nasal grop med…

Discussion

I vår studie testades olika fixeringsmedel, dehydrering och torkmetoder för att förbereda tre olika känsliga biologiska prover för SEM-avbildning: embryon, äggskal och svamp kulturer. SEM används ofta för ytanalys, så fixativ penetration är mindre om, men det måste förstås att dåligt fasta interna strukturer kommer att orsaka inåt krympande eller/och kollapsade ytstrukturer. Förlängd bindningstid bör också övervägas för större vävnadsprover, som ersätter den fixerande lösningen några gånger be…

Materials

Agar	Fischer Scientific	S25127A	for slide cultures
Aluminum pin stub	Tedpella	16111	12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotic for media
Coarse Vermiculite	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	bedding medium
Clear 12- well plate	Corning	07-201-589	for fixing embryo
Coverslips	Fischer Scientific	S17525B	for slide culture
Critical Point Dryer	Quorum CPD	EMS850	critical point drying
Culture dishes	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol	Fischer Scientific	A406P 4	dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers	Tedpella	5804	style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde	Fischer Scientific	G151-1	fixative
Gold target for sputter coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	chemical drying agent
Kim wipes	Kimtech	S-8115	cleaning
Microscope slides	Thermo Scientific	67-762-16	for slide culture
Microscopy Scissors	Tedpella	1327	Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors	Tedpella	1346	Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts	Corning	0330B09	15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde	Fischer Scientific	T353 500	fixative
Peat moss	Walmart- Miracle Gro	551705263	bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	thin metal coating
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	electron microscopy