Traitement de l'embryon, de la coquille d'œuf et de la culture fongique pour la microscopie électronique à balayage

Résumé

Ici, nous présentons des protocoles détaillés de traitement pour l'imagerie des échantillons de tissus délicats à l'aide de la microscopie électronique à balayage (SEM). Trois méthodes de traitement différentes, à savoir, le séchage chimique du disilazana hexaméthylique (HMDS), le séchage simple à l'air et le séchage à points critiques sont décrits pour la préparation de coquilles d'œufs rigides, d'embryons à un stade de développement précoce et de cultures fongiques respectivement.

Résumé

Bien que la microscopie électronique à balayage (SEM) soit largement utilisée pour l'analyse ultra-structurale de divers échantillons biologiques et non biologiques, les méthodes impliquées dans le traitement de différents échantillons biologiques impliquent des pratiques uniques. Toutes les pratiques conventionnelles décrites dans la littérature pour le traitement des échantillons trouvent encore des applications utiles, mais des changements subtils dans la préparation de l'échantillon peuvent modifier la qualité de l'image, ainsi que, introduire des artefacts. Par conséquent, l'utilisation d'une technique unique de préparation d'échantillons spécifique au type de tissu analysé est nécessaire pour obtenir une image de bonne qualité avec une résolution ultrastructurale. L'objectif de cette étude est de fournir les protocoles optimaux de préparation de l'échantillon pour l'imagerie des embryons, des coquilles d'œufs rigides et des cultures fongiques à l'aide de SEM. Les optimisations suivantes ont été recommandées pour donner de bons résultats pour les trois différents échantillons biologiques délicats étudiés. L'utilisation de fixatifs plus doux comme le paraformaldéhyde de 4 % ou le glutaraldéhyde de 3 % suivi de la déshydratation avec la série d'éthanol est obligatoire. Le mycélium fongique sur les blocs d'agar obtenus par les cultures de diapositives donne une meilleure intégrité ultrastructurale par rapport aux cultures prises directement à partir de plaques d'agar. Le séchage chimique des embryons avec HMDS permet le séchage sans introduire d'artefacts de tension de surface par rapport au séchage à points critiques. Le SMDM empêche la fissuration causée par le rétrécissement, car les échantillons sont moins cassants pendant le séchage. Cependant, pour la culture fongique, le séchage par point critique offre une qualité d'image acceptable par rapport au séchage chimique. Les coquilles d'œufs peuvent être représentées sans étapes de préparation spéciales, sauf pour un lavage complet et un séchage à l'air avant le montage. Les méthodes de préparation ont été normalisées en fonction de la qualité d'image acceptable obtenue à chaque essai.

Introduction

L'analyse ultrastructurale de microscope électronique de balayage (SEM) et la microscopie intracellulaire de formation image complètent la lumière pour le profilage tridimensionnel des procaryotes, des usines, et des animaux. La haute résolution spatiale d'un SEM en fait l'une des techniques les plus polyvalentes et les plus puissantes disponibles pour l'examen des caractéristiques microstructurales des spécimens à l'échelle nanométrique à micromètre. Les spécimens desséchés sont résolus aux structures compositionnelles et topographiques avec le détail intense, qui fournit la base pour développer des conclusions valides au sujet des relations fonctionnelles

Protocole

REMARQUE : Des œufs de tortue sépareuse (Chrysemys picta) utilisés dans cette étude ont été recueillis pendant la saison de nidance de mai à juin 2015-16 à partir de la station Rice Creek Field, Oswego New York, avec la permission du Département de l'environnement de l'État de New York. Conservation (DEC).

1. Méthode de séchage chimique pour traiter les embryons pour SEM

1. Recueillir les œufs de tortue s'ils proviennent des champs pendant la saison de nidification. Préparer les chambres d'incubation à l'avance, faites de boîtes en plastique avec couvercles (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm remplis de milieu de literie ....

Résultats

La figure 1 montre l'analyse micrographique électronique de balayage des embryons peints de tortue (Chrysemyspicta). Des œufs de tortue peints recueillis et incubés sur un support de literie, montés sur des talons d'aluminium à la suite d'un séchage chimique, ont été utilisés pour l'imagerie SEM (figure1A-E). Une vue latérale d'un embryon de stade 12 montre les structures craniofacial ; la proéminence maxillaire s'étend au-delà du mand.......

Discussion

Dans notre étude, différents agents de fixation, méthodes de déshydratation et de séchage ont été testés pour préparer trois différents échantillons biologiques délicats pour l'imagerie SEM : embryons, coquilles d'œufs et cultures fongiques. SEM est couramment utilisé pour l'analyse de surface, de sorte que la pénétration fixative est moins préoccupante, mais il faut comprendre que les structures internes mal fixées causeront le rétrécissement vers l'intérieur ou / et les structures de surface effondrées. Le temps de fix.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar	Fischer	Scientific S25127A	pour cultures sur lames
Embout de broche en aluminium	Tedpella	16111	12,7 mm x 8 mm
BD Difco Milieu de culture déshydraté : Pomme de terre Dextrose Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Milieu pour l’isolement et la culture de champignons, de levures et de moisissures
Chloramphénicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotique pour milieu
Vermiculite grossière	Serre Megastore	SO-VER-12	litière moyenne
Transparent Plaque 12 puits	Corning	07-201-589	pour la fixation d’embryons
Lamelles	Fischer Scientific	S17525B	pour culture sur lames
Séchoir à point critique	Quorum CPD	EMS850	Séchage à point critique
Plats de culture	Fischer Scientific	08 747B	PARABOLE PETRI 100X10MM 12/PK
Éthanol	Fischer Scientific	A406P 4	agent de déshydratation
Forceps- Aquarius Pince à épiler	Tedpella	5804	style 4, longueur 108mm, largeur x épaisseur 0,017 x 0,17 mm
Glutaraldéhyde	Fischer Scientific	G151-1	fixateur
Cible dorée pour vernisseuse par pulvérisation cathodique	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Cible d’or, 2,375 et taux préférentiel ; d x .002&prime ;
Hexaméthyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	agent de séchage chimique
Kim lingettes	Kimtech	S-8115	Lames de
microscope	Thermo Scientific	67-762-16	pour culture de lames
Ciseaux de microscopie	Tedpella	1327	Double pointe, acier inoxydable, 100 mm L (3-5/8").
Micro-ciseaux	Tedpella	1346	type Vannas, droit, 80mm L
Moria Cuillère à embryons perforée Fine	Science Tools	10370-17	Longueur 14,5 cm, diamètre de la pointe 20 mm, profondeur de la cuillère 5 mm
Netwell Inserts	Corning	0330B09	15 mm Inserts avec 74 µ ; m Taille de maille La membrane en polyester agit comme un support pratique lors du traitement des échantillons dans différents solvants
Paraformaldéhyde	Fischer Scientific	T353 500	fixateur
Mousse de tourbe	Walmart- Miracle Gro	551705263	literie moyenne
PELCO languettes PELCO double bâton ruban conducteur de carbone	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	revêtement métallique mince
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV	électronique

microscope à balayage