円形RT-PCRベースの戦略を用いたトウモロコシミトコンドリオンにおける一次写物と処理された転写物の判別とマッピング
Summary
円形RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5’ポリホスファターゼ処理、ノーザンブロットを組み合わせることで、循環RT-PCRベースの戦略を提示する。このプロトコルには、不安定な5’三リン酸の影響を最小限に抑えるための正規化ステップが含まれており、トウモロコシミトコンドリオンに安定して蓄積された一次および処理された転写物を識別およびマッピングするのに適しています。
Abstract
植物ミトコンドリアでは、一部の定常転写物は転写開始(一次転写)に由来する5’三リン酸を有し、他のものは転写後に生成された5’モノリン酸(処理された転写物)を含む。2種類の転写物を区別するために、いくつかの戦略が開発され、それらのほとんどは5’三リン酸の存在/不在に依存しています。しかし、原発5’ターミニーニにおける三リン酸は不安定であり、2種類の転写物の明確な判別を妨げる。トウモロコシミトコンドリオンに安定して蓄積された一次転写物と処理された転写物を系統的に区別してマッピングするために、cRT-PCR、RNA 5’ポリフォシュパターゼ処理、定量的な組み合わせにより、循環RT-PCR(cRT-PCR)ベースの戦略を開発しました。RT-PCR (RT-qPCR)、およびノーザン ブロット。改善として、この戦略は、不安定な5’三リン酸の影響を最小限に抑えるためのRNA正規化ステップを含む。
このプロトコルでは、濃縮されたミトコンドリアRNAは、RNA 5’ポリホスファターゼによって前処理され、5’トリフショファトを一リン酸に変換する。円形化および逆転転写後、5’ポリホスファターゼおよび非処理RNAに由来する2つのcDNは、処理された5’末端を有し、5’ポリホスファターゼに無感覚であるトウモロコシ26S成熟rRNAによって正規化される。正規化後、一次転写物と処理された転写物は、治療されたRNAおよび非処理されたRNAから得られたcRT-PCRおよびRT-qPCR産物を比較することによって判別される。トランスクリプトターミニは、cRT-PCR産物のクローニングとシーケンシングによって決定され、次いでノーザンブロットによって検証されます。
この戦略を用いることで、トウモロコシミトコンドリオンにおける最も定常状態の転写物が決定された。いくつかのミトコンドリア遺伝子の複雑な転写パターンのために、いくつかの定常転写は、北部のブロットで検出されたが、分化および/またはマッピングされなかった。この戦略が他の植物ミトコンドリアまたはプラスティドで定常状態の転写物を差別し、マッピングするのに適しているかどうかは分かりません。
Introduction
植物ミトコンドリアでは、多くの成熟した前駆体RNAが複数のアイソフォームとして蓄積され、定常状態の転写物は5’終端1、2、3の差に基づいて2つのグループに分けることができる。 4.一次転写物は、転写開始に由来する5’三リン酸端を有する。対照的に、処理された転写物は、転写後処理によって生成される5’モノリン酸を持っています。2種類の転写物の判別とマッピングは、転写および転写終了の成熟の基礎となる分子メカニズムを解明するために重要である。
植物ミトコンドリオンの一次転写物と加工トランスクリプトを区別するために、4つの主要な戦略が開発されました。最初の戦略は、5’三リン酸を一リン酸に変換し、一次転写物をRNAリゲスによって円形にすることを可能にするタバコ酸ピロホスファターゼ(TAP)でミトコンドリアRNAを前処理することです。TAP処理および非処理RNAサンプルの転写物の豊富さは、次いで、cDNA端部(RACE)または円形RT-PCR(cRT-PCR)2、3、4の迅速な増幅によって比較される。第2の戦略では、処理された転写物は、まずターミネータ5′-リン酸塩依存性エキノールクレアーゼ(TEX)を使用してミトコンドリアRNAから枯渇し、残された一次転写物はプライマー延長分析5、6によってマッピングされる。.第3の戦略は、グアニルトランスフェラーゼを使用して一次転写物をプレキャップし、その後、トリリン化された5’ターミニの位置は、リボヌクレアーゼまたはS1ヌクレアーゼ保護分析7、8と一緒にプライマー延長によって決定されます 、9.5’三リン酸の有無に応じて異なり、第4の戦略は、インビトロ転写、部位指向変異形成、およびプライマー拡張分析を組み合わせて、形成促進剤を特徴付け、転写を決定する開始サイト8,10,11.これらの戦略を使用することにより、多くの一次および処理された転写物は、植物ミトコンドリアで決定されている。
しかし、いくつかの研究は、一次転写物の5’三リン酸が不安定であり、それらは2、4、12、13の未知の理由で簡単に一リン酸塩に変換されたと報告している。この問題は、5’三リン酸の有無に応じて技術を使用して、2種類の転写物の明確な差別を妨げ、および植物の一次転写と処理された転写物を系統的に区別する以前の努力を妨げるミトコンドリアは失敗した 2,12.
このプロトコルでは、cRT-PCR、RNA 5’ポリホスファターゼ処理、RT-qPCR、およびノーザンブロットを組み合わせて、トウモロコシに安定に蓄積された一次転写物と処理された転写物を系統的に区別する(Zeamays)ミトコンドリオン(図1)。cRT-PCRは、RNA分子の5’および3’四肢の同時マッピングを可能にし、通常、植物2、12、14、15における転写ターミニをマッピングするように適応される。RNA 5′ ポリホスファターゼは、三リン酸化された5’テルミニから2つのリン酸塩を除去することができ、これはRNAリガーゼによる自己ライゲーションのために一次転写物を利用できるようにする。以前の研究では、トウモロコシの成熟した26S rRNAが5’終産を処理し、RNA 5’ポリホスファターゼ1、16に対して無感覚であったことが示された。原発5’ターミニニにおける不安定な三リン酸の影響を最小限に抑えるために、5’ポリホスホナーゼ処理および非処理RNAは成熟した26S rRNAによって正規化され、その後、一次および処理された転写物は、2つのRNAサンプルから得られたcRT-PCR産物。cRT-PCR マッピングと判引結果は、それぞれノーザン ブロットと RT-qPCR によって検証されます。最後に、代替プライマーは、cRT-PCRではなく、北部ブロットで検出されたそれらの転写物を増幅するために使用されます。このcRT-PCRベースの戦略を使用することにより、トウモロコシミトコンドリオンのほとんどの定常状態の転写物が区別され、マッピングされた1.
Protocol
Representative Results
Discussion
以前の研究では、アラビドプシスの細胞懸濁培養物からの合計およびミトコンドリアRNAをcRT-PCRによるミトコンドリア転写テルミニーニのマッピングに使用し、同様の結果が12を得た。しかし、他の多くの研究1、2、3、9においてミトコンドリア転写テルミニをマッピングするために濃縮<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金第31600250号、Y.Z.)、広州市科学技術プロジェクト(助成金第201804020015号、H.N.)、中国農業研究システム(助成金なし)によって支援されました。CARS-04-PS09,H.N.)。
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
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