Un protocole pour la synthèse et la mesure des propriétés photochimiques des composés modulaires en cage avec des moieties cliquables est présenté.
Les composés en cage permettent la manipulation photo-négociée de la physiologie cellulaire avec la résolution spatiotemporal élevée. Cependant, la diversité structurelle limitée des groupes de mise en cage actuellement disponibles et les difficultés de modification synthétique sans sacrifier leur efficacité de la photolyse sont des obstacles à l’élargissement du répertoire des composés en cage pour les cellules vivantes Applications. Comme la modification chimique des groupes de photo-cage de type coumarin est une approche prometteuse pour la préparation de composés en cage avec diverses propriétés physiques et chimiques, nous rapportons une méthode pour la synthèse des composés en cage cliquables qui peuvent être modifiés facilement avec diverses unités fonctionnelles par l’intermédiaire de la cyclisation de Huisgen de cuivre (I)-catalysé. La molécule de plate-forme modulaire contient un groupe (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)methyl (Bhc) en tant que groupe photo-caging, qui présente une efficacité élevée de photolyse par rapport à ceux des 2-nitrobenzyls conventionnels. Des procédures générales pour la préparation des composés en cage cliquables contenant des amines, des alcools et des carboxylates sont présentées. D’autres propriétés telles que la solubilité de l’eau et la capacité de ciblage cellulaire peuvent être facilement incorporées dans des composés en cage cliquables. En outre, les propriétés physiques et photochimiques, y compris le rendement quantique de la photolyse, ont été mesurées et se sont avérées supérieures à celles des composés en cage Bhc correspondants. Le protocole décrit pourrait donc être considéré comme une solution potentielle au manque de diversité structurelle dans les composés en cage disponibles.
Les composés en cage sont des molécules synthétiques conçues dont les fonctions d’origine sont masquées temporellement par des groupes de protection photo-amovibles covalents. Fait intéressant, les composés en cage de molécules biologiquement pertinentes fournissent une méthode indispensable pour le contrôle spatiotemporal de la physiologie cellulaire1,2,3,4,5 ,6. En 1977, Engels et Schlaeger ont signalé l’ester 2-nitrobenzyl de cAMP comme dérivé perméable et photolabile de la membrane 7. L’année suivante, Kaplan a signalé le 1-(2-nitrophenyl)ester éthylique de l’ATP (NPE-ATP) et a nommé ce composé “caged” ATP8. Depuis lors, une gamme de groupes de protection photochimiquement amovibles tels que 2-nitrobenzyls, p-hydroxyphényacyls9, 2-(2-nitrophenyl)ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, et (coumarin-4-yl)méthyls14,15,16 ont été utilisés pour la préparation de composés en cage.
On s’attendrait à ce que la synthèse des composés en cage avec des propriétés additionnelles souhaitables telles que la perméabilité de membrane, la solubilité d’eau, et la capacité de ciblage cellulaire facilite des applications biologiques de cellules. Étant donné que les propriétés physiques et photochimiques de ces molécules dépendent principalement de la structure chimique des groupes de protection photochimiquement amovibles utilisés pour les préparer, un répertoire diversifié de groupes de photo-cage est nécessaire. Cependant, la diversité structurelle des groupes de mise en cage actuellement disponibles qui présentent une grande efficacité en matière de photolyse est limitée. Cela pourrait être un obstacle à l’augmentation de l’utilisation de composés en cage.
Pour résoudre ce problème, le répertoire des groupes de photo-cage a été élargi par la modification chimique des groupes de protection photoamovibles existants ou la conception de nouveaux chromophores photolabile avec des propriétés photophysiques et photochimiques supérieures. Par exemple, nitrodibenzofuran (NDBF)17, [3-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)-2-butyl] (DMNPB)18,19, un calcium sensible 2-nitrobenzyl photocage20, remplacé coumarinylmethyls (DEAC45021 , DEAdcCM22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, et styryl coumarins24), dérivés de la cyanine (CyEt-pan)25, et les dérivés BODIPY26,27.
En outre, nous avons précédemment développé le (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)méthyl (Bhc) groupe et avec succès synthétisé divers composés en cage des neurotransmetteurs28, deuxième messagers29,30, et oligonucléotides31,32,33 présentant de grandes sections d’excitation d’un et deux photons. Si des propriétés supplémentaires peuvent être installées facilement dans les groupes de mise en cage sans compromettre leur photosensibilité, alors le répertoire des composés en cage peut être élargi34,35,36, 37,38,39. Nous avons donc conçu des composés modulaires en cage qui comprennent trois parties, à savoir le groupe Bhc comme un noyau photo-réactif, poignées chimiques pour l’installation de fonctionnalités supplémentaires, et les molécules qui doivent être masqués40, 41.
Ainsi, cet article fournit une méthode pratique pour la préparation des composés en cage de molécules biologiquement pertinentes. Le présent protocole décrit les méthodes de préparation d’une plate-forme cliquable pour les groupes de photo-cage, l’introduction de fonctionnalités supplémentaires pour élargir le répertoire des composés en cage, la mesure de leur physique et photochimique et le ciblage sélectif de type cellulaire d’un composé en cage cliquable pour une application cellulaire ultérieure.
Nous avons précédemment développé des composés en cage Bhc de diverses molécules biologiquement actives qui présentent des efficacités photolytiques élevées28,45,46,47. Dans le but d’élargir le répertoire des groupes de mise en cage Bhc, nous avons également signalé des plates-formes de composés modulaires en cage qui peuvent être modifiés facilement par l’introduction de diverses unités fonctionnelles32,40,41. Le protocole actuel représente donc une méthode de synthèse d’un précurseur cliquable de groupes de cages Bhc qui peuvent être modifiés par l’intermédiaire de la cyclisation huisgen catalysée par le cuivre (I) catalysée. La synthèse du précurseur cliquable, paBhcCH2OH (2), a été réalisée par une séquence de réaction en quatre étapes à partir du 4-bromoresorcinol disponible dans le commerce (Figure 1A). L’avantage du protocole actuel est qu’aucune étape laborieuse de purification (par exemple, séparations chromatographiques de colonne) n’est exigée.
Comme précurseur cliquable paBhcCH2OH (2) peut être utilisé pour masquer divers groupes fonctionnels, les composés en cage cliquables d’amines, d’alcools et d’acides carboxyliques ont été synthétisés à l’aide de 2 comme précurseur (Figure 1B). Les amines ont été modifiées comme leurs carabines tandis que les alcools ont été modifiés comme leurs carbonates. Dans les procédures générales 1 et 2, CDI a été utilisé pour la préparation de carbamates cliquables, tandis que le chloroformate 4-nitrophenyl a été utilisé pour la préparation de carbonates. Comme l’indique le mécanisme de réaction, les deux réactifs peuvent être utilisés pour la préparation des carbamates et des carbonates. Il convient également de noter que le rendement du composé en cage désiré dépend de la structure chimique de la molécule à mettre en cage. D’autres exemples peuvent être vus dans nos rapports précédents28,30,33,48.
La modification de clic a ensuite été effectuée en utilisant une légère modification de la procédure déclarée49. L’ajout de ligands à base de tris (triazolylmethyl) est nécessaire pour obtenir les produits désirés dans des rendements bons à élevés. Étant donné qu’une variété d’azides sont facilement accessibles à la fois de sources commerciales et de procédures de littérature, nous pouvons préparer divers composés modulaires en cage avec des propriétés supplémentaires telles que la solubilité de l’eau et la capacité de ciblage cellulaire (Figure 2).
Le rendement quantique de la photolyse a ensuite été mesuré selon une procédure rapportée28,50. La figure 3 montre que la consommation photolytique de 2 ‘glc-paBhcmoc-PTX et la libération de PTX ont été approximatives par la désintégration et l’élévation mono-exponentielle, respectivement, suggérant aucun filtrage intérieur du rayonnement ou des effets secondaires indésirables. Des rendements quantiques améliorés de photolyse() et des efficacités de photolyse ()ont été observés pour les composés en cage de paBhc cliquables comparés à ceux des composés en cage de Bhc précédemment rapportés (tableau 1)41, 43. Étant donné que l’efficacité de la photolyse() des composés en cage de Bhc sont plus de cent fois plus élevées que celles des composés en cage de type 2-nitrobenzyl48, l’amélioration marquée due à la présence de groupes de cinage paBhc est clairement un avantage pour ce système.
Comme une expérience de preuve de concept, une moiety hydrophile a été introduite dans 2 ‘-paBhcmoc-PTX (4) et un ligand de ciblage cellulaire a été introduit dans le composé 3 (Figure 2). La solubilité de l’eau de 2 ‘glc-paBhcmoc-PTX était 650 fois plus élevée que celle de la mère PTX (tableau 1). Le ciblage cellulaire sélectif a été réalisé à l’aide d’un système de sonde d’étiquettes, et paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) portant le ligand HaloTag a été ciblé avec succès sur la membrane cellulaire des cellules mammifères cultivées exprimant la protéine de fusion HaloTag/EGFR ( Figure 4). La modulation photo-négociée de la localisation subcellulaire d’une kinase a également été réalisée à l’aide d’un composé en cage cliquable 5 (figure 5).
En conclusion, nous avons démontré avec succès une méthode pour la préparation de plates-formes cliquables pour les composés photo-caged des molécules biologiquement intéressantes qui peuvent être modifiés facilement avec des propriétés additionnelles, telles que la solubilité d’eau et un cellulaire capacité de ciblage. Puisque le groupe de mise en cage de paBhc peut être employé pour préparer n’importe quelle molécule avec des groupes fonctionnels modifiables, l’application du protocole actuel n’est pas limitée aux molécules décrites ci-contre. À l’aide d’une plate-forme modulaire, à savoir le groupe de mise en cage paBhc, les composés en cage désirés peuvent être facilement préparés, et leurs propriétés physiques et chimiques peuvent être modulées par modification de clic.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par jSPS KAKENHI numéro de subvention JP16H01282 (TF), une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants “Memory Dynamic,” et JP19H05778 (TF), “MolMovies”.
acetonitrile, EP | Nacalai | 00404-75 | |
acetonitrile, super dehydrated | FUJIFILM Wako | 010-22905 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
4-bromoresorcinol | TCI Chemicals | B0654 | |
N,N’-carbonyldiimidazole | FUJIFILM Wako | 034-10491 | |
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Ethyl 4-Chloroacetoacetate | TCI Chemicals | C0911 | |
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red | FUJIFILM Wako | 087-08335 | |
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1,10‐Phenanthroline Monohydrate | Nacalai | 26707-02 | |
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps | Rayonet | ||
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Xenon light source, MAX-303 | Asahi Spectra |