Modüler kafesli bileşiklerin tıklanabilir moieties ile fotokimyasal özelliklerinin sentezi ve ölçümü için bir protokol sunulmuştur.
Kafesli bileşikler yüksek spatiotemporal çözünürlük ile hücre fizyolojisinin fotoğraf aracılı manipülasyon sağlar. Ancak, şu anda mevcut caging gruplarının sınırlı yapısal çeşitliliği ve fotolik verimliliklerinden ödün vermeden sentetik modifikasyondaki zorluklar, canlı hücre için kafesli bileşiklerin repertifesini genişletmenin önündeki engellerdir. Uygulama. Coumarin tipi foto-caging gruplarının kimyasal modifikasyonu, çeşitli fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip kafesli bileşiklerin hazırlanması için umut verici bir yaklaşım olduğundan, değiştirilebilir tıklanabilir kafesli bileşiklerin sentezi için bir yöntem rapor ediyoruz. bakır(I)-katalize Huisgen siklizasyon yoluyla çeşitli fonksiyonel birimleri ile kolayca. Modüler platform molekülü bir (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)metil (Bhc) grubu bir foto-caging grubu olarak içerir, hangi geleneksel 2-nitrobenzyls göre yüksek fotoliz verimliliği sergiler. Amin, alkol ve karboksilat içeren tıklanabilir kafesli bileşiklerin hazırlanması için genel prosedürler sunulmaktadır. Su çözünürlüğü ve hücre hedefleme yeteneği gibi ek özellikler kolayca tıklanabilir kafesli bileşikler dahil edilebilir. Ayrıca, fotolik kuantum verimi de dahil olmak üzere fiziksel ve fotokimyasal özellikleri ölçüldü ve ilgili Bhc kafesli bileşiklerin daha üstün olduğu bulunmuştur. Bu nedenle açıklanan protokol, mevcut kafesli bileşiklerdeki yapısal çeşitliliğin olmaması için potansiyel bir çözüm olarak düşünülebilir.
Kafesli bileşikler, orijinal işlevleri kovalent olarak bağlı foto çıkarılabilir koruma grupları tarafından zamansal olarak maskelenen sentetik moleküller olarak tasarlanmıştır. İlginçtir, biyolojik olarak ilgili moleküllerin kafesli bileşikler hücresel fizyoloji1,2,3,4,5 spatiotemporal kontrolü için vazgeçilmez bir yöntem sağlar ,6. 1977 yılında, Engels ve Schlaeger cAMP bir membran geçirgen ve fotolabile türevi cAMP72-nitrobenzyl ester bildirdi. Ertesi yıl Kaplan, ATP’nin (NPE-ATP) 1-(2-nitrofenil)etil esterini rapor etti ve bu bileşiği “kafesli” ATP8olarak adlandırdı. O zamandan beri, fotokimyasal olarak çıkarılabilir koruma grupları 2-nitrobenzyls, p-hidroksifenil9, 2-(2-nitrofenil)ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, ve (coumarin-4-yl)metiller14,15,16 kafesli bileşiklerin hazırlanması için kullanılmıştır.
Membran geçirgenliği, suda çözünürlüğü ve hücresel hedefleme yeteneği gibi arzu edilen ek özelliklere sahip kafesli bileşiklerin sentezinin hücre biyolojik uygulamalarını kolaylaştırması beklenmektedir. Bu moleküllerin fiziksel ve fotokimyasal özellikleri öncelikle onları hazırlamak için kullanılan fotokimyasal çıkarılabilir koruma gruplarının kimyasal yapısına bağlı olduğundan, foto-caging gruplarının farklı bir repertoire gereklidir. Ancak, yüksek fotolik verimliliği sergileyen mevcut caging gruplarının yapısal çeşitliliği sınırlıdır. Bu kafesli bileşiklerin kullanımını artırmak için bir engel olabilir.
Bu sorunu gidermek için, foto-caging grupların repertuarı mevcut fotoremovable koruma gruplarının kimyasal modifikasyonu veya üstün fotofizik ve fotokimyasal özelliklere sahip yeni fotolabile kromoforların tasarımı ile genişletildi. Örnekler nitrodibenzofuran (NDBF)17, [3-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenil)-2-butil] (DMNPB)18,19, kalsiyumduyarlı 2-nitrobenzyl fotocage20, yerine komarinylmeethyls (DEAC45021 , DEAdcCM22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, ve styryl coumarins24), siyanür türevleri (CyEt-pan)25, ve BODIPY türevleri26,27.
Buna ek olarak, daha önce (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)metil (Bhc) grubu geliştirdik ve başarılı nörotransmitterlerin çeşitli kafesli bileşikler sentezlenmiş28, ikinci haberciler29,30, ve oligonükleotidler31,32,33 büyük bir ve iki foton uyarma kesitleri sergileyen. Ek özellikler onların Fotosensitivite ödün vermeden caging gruplarına kolayca kurulabilir, o zaman kafesli bileşiklerin repertoiregenişletilebilir 34,35,36, 37,38,39. Bu nedenle üç bölümden oluşan modüler kafesli bileşikler tasarladık, yani bir fotoğraf duyarlı çekirdek olarak Bhc grubu, ek işlevlerin kurulumu için kimyasal kolları, ve maskelenecek moleküller40, 41. yıl.
Böylece, bu makalede biyolojik olarak ilgili moleküllerin kafesli bileşiklerin hazırlanması için pratik bir yöntem sağlar. Bu protokol, foto-caging grupları için tıklanabilir bir platform hazırlanması için yöntemler açıklar, kafesli bileşiklerin repertuarGenişletmek için ek işlevlerin giriş, fiziksel ve fotokimyasal ölçümü özellikleri ve daha fazla hücresel uygulama için tıklanabilir kafesli bileşiğin hücre tipi seçici hedefleme.
Daha önce yüksek fotolitik verimlilik28,45,46,47sergileyen çeşitli biyolojik olarak aktif moleküllerin Bhc kafesli bileşikler geliştirdi. Bhc caging gruplarının repertoire genişletilmesi amacı ile, biz de çeşitli fonksiyonel birimlerin tanıtımı ile kolayca değiştirilebilir modüler kafesli bileşiklerin platformları bildirdi32,40,41. Bu nedenle bu protokol, bakır(I)-katalize Huisgen siklizasyonu ile değiştirilebilen Bhc caging gruplarının tıklanabilir bir öncüsünün sentezi için bir yöntem temsil eder. Tıklanabilir öncül sentezi, paBhcCH2OH (2), ticari olarak kullanılabilir 4-bromoresorcinol başlayan dört adımlı reaksiyon dizisi ile elde edildi (Şekil 1A). Mevcut protokolün avantajı, zahmetli arınma adımlarının (örneğin, sütun kromatografik ayrımları) gerekli olmamasıdır.
Tıklanabilir öncül paBhcCH2OH (2) çeşitli fonksiyonel grupları maskelemek için kullanılabilir gibi, aminlerin tıklanabilir kafesli bileşikler, alkoller, ve karboksilik asitler öncüsü olarak 2 kullanılarak sentezlendi (Şekil 1B). Aminler karbamates olarak modifiye edildi, alkoller ise karbonat olarak modifiye edildi. Genel prosedürler 1 ve 2’de tıklanabilir karbamatelerin hazırlanmasında CDI, karbonatların hazırlanmasında ise 4-nitrofenil kloroformate kullanılmıştır. Reaksiyon mekanizmasından da anlaşılarak, her iki reaktif de karbatür ve karbonat ların hazırlanmasında kullanılabilir. Ayrıca istenilen kafesli bileşiğin verimi kafesli edilecek molekülün kimyasal yapısına bağlıdır unutulmamalıdır. Diğer örnekler önceki raporlarımızda görülebilir28,30,33,48.
Tıklama modifikasyonu daha sonra bildirilen yordamın küçük bir değişiklik kullanılarak yapıldı49. Tris (triazolylmethyl)amin bazlı ligands eklenmesi yüksek verim iyi istenilen ürünleri elde etmek için gereklidir. Çeşitli azideler hem ticari kaynaklardan hem de literatür prosedürlerinden kolayca elde edilebildiği için, su çözünürlüğü ve hücresel hedefleme yeteneği gibi ek özelliklere sahip çeşitli modüler kafesli bileşikler hazırlayabiliriz(Şekil 2).
Fotolik kuantum verimi daha sonra bildirilenprosedür28,50göre ölçüldü . Şekil 3, 20-glc-paBhcmoc-PTX’in fotolitik tüketimi ve PTX salınımının sırasıyla tek üstel bozunma ve yükselme ile yaklaşık olarak, radyasyonun iç filtreleme veya istenmeyen ikincil etkilere işaret ettiğini göstermektedir. Geliştirilmiş fotolik kuantum verimleri(Φ) ve fotolik isbik verimlilikleri(εΦ)daha önce bildirilen Bhc kafesli bileşikler(Tablo 1)41 ile karşılaştırıldığında tıklanabilir paBhc kafesli bileşikler için gözlendi , 43– Bhc kafesli bileşiklerin fotolik verimi(εΦ)2-nitrobenzil tipi kafeslibileşikler48’denyüz kat daha yüksek olduğundan, paBhc caging gruplarının varlığından kaynaklanan belirgin iyileşme açıkça bu sistem için bir avantaj.
Kavram kanıtı deneyi olarak 20-paBhcmoc-PTX(4)içine hidrofilik moiety, bileşik 3’e hücresel hedefleme ligandı(Şekil 2)getirilmiştir. 20-glc-paBhcmoc-PTX’in su çözünürlüğü ana PTX’ten 650 kat daha yüksekti (Tablo 1). Selektif hücresel hedefleme bir etiket-prob sistemi kullanılarak elde edildi ve HaloTag ligand’ı taşıyan paBhcmoc-hex-FITC/Halo(8)HaloTag/EGFR füzyon proteinini ifade eden kültürlü memeli hücrelerinin hücre zarına başarıyla hedeflenmiştir ( Şekil 4). Bir kizazın hücre altı lokalizasyonunun foto-aracılı modülasyonu da tıklanabilir kafesli bileşik 5 kullanılarak elde edilmiştir(Şekil 5).
Sonuç olarak, biyolojik olarak ilginç moleküllerin foto kafesli bileşikleri için tıklanabilir platformların hazırlanması için bir yöntem başarıyla gösterdik. hedefleme yeteneği. PaBhc caging grubu değiştirilebilir fonksiyonel gruplara sahip molekülleri hazırlamak için kullanılabildiğinden, mevcut protokolün uygulanması burada tanımlanan moleküllerle sınırlı değildir. Modüler bir platform kullanarak, yani paBhc caging grubu, istenilen kafesli bileşikler kolayca hazırlanabilir, ve fiziksel ve kimyasal özellikleri tıklama modifikasyonu ile modüle edilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma JSPS KAKENHI hibe numarası JP16H01282 (TF), Yenilikçi Alanlar “Bellek Dinamizm bilimsel araştırma için hibe-in-Aid” ve JP19H05778 (TF), “MolMovies tarafından desteklenmiştir.”
acetonitrile, EP | Nacalai | 00404-75 | |
acetonitrile, super dehydrated | FUJIFILM Wako | 010-22905 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
4-bromoresorcinol | TCI Chemicals | B0654 | |
N,N’-carbonyldiimidazole | FUJIFILM Wako | 034-10491 | |
chloroform | Kanto | 07278-71 | |
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% | FUJIFILM Wako | 032-12511 | |
dichloromethane, dehydrated | Kanto | 11338-05 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) | TCI Chemicals | D0254 | |
4-dimethylaminopyridine | TCI Chemicals | D1450 | |
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- | Kanto | 10380-05 | |
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Sigma | D6046-500ML | |
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW | Olympus | ||
Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako | 054-07225 | |
Ethyl 4-Chloroacetoacetate | TCI Chemicals | C0911 | |
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red | FUJIFILM Wako | 087-08335 | |
hydrochloric acid | FUJIFILM Wako | 087-01076 | |
inverted fluorescent microscope IX-71 | Olympus | ||
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL | Biotage | 120-1906-D | |
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | FUJIFILM Wako | 196-01252 | |
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 | Olympus | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | 11668027 | lipofection reagent |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Dojindo | 345-01804 | MOPS |
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) | TCI Chemicals | C1400 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Thermo Fisher | 11058021 | reduced serum medium contains no phenol red |
1,10‐Phenanthroline Monohydrate | Nacalai | 26707-02 | |
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps | Rayonet | ||
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate | FUJIFILM Wako | W01SRM19-5000 | |
Sodium Acetate Trihydrate | Nacalai | 31115-05 | |
Sodium Bicarbonate | FUJIFILM Wako | 199-05985 | |
Sulfuric Acid, 96-98% | FUJIFILM Wako | 190-04675 | |
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | ALDRICH | 762342-100MG | |
tri‐Sodium Citrate Dihydrate | Nacalai | 31404-15 | |
Xenon light source, MAX-303 | Asahi Spectra |