등갈 뿌리 신경절 대식세포의 신속한 절연
Summary
여기서 우리는 표현형 및 기능 분석을 위해 등쪽 뿌리 신경절에서 대식세포를 신속하게 분리하는 기계적 해리 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
말초 신경 손상 후 등쪽 뿌리 중추에서 면역 세포와 감각 뉴런 간의 분자 및 세포 상호 작용을 연구하는 관심사가 증가하고 있습니다. 대식세포를 포함한 말초 단낭세포는 식세포증, 항원 프리젠테이션 및 사이토카인 방출을 통해 조직 손상에 반응하는 것으로 알려져 있다. 새로운 증거는 신경 손상의 맥락에서 신경 병성 통증 개발 및 축색 수리에 등계 뿌리 신경절 대식세포의 기여를 연루하고있다. 급속하게 phenotyping (또는 “급속한 격리”) 신경 상해의 맥락에서 등대 근 신경절 대식세포의 반응은 알려지지 않은 신경면역 요인을 확인하기 위하여 요구된다. 여기에서 우리는 우리의 실험실이 효소가 없는 기계적인 해리 프로토콜을 사용하여 등쪽 뿌리 중추에서 대식세포를 신속하고 효과적으로 분리하는 방법을 보여줍니다. 견본은 세포 스트레스를 제한하기 위하여 얼음에 보관됩니다. 이 프로토콜은 표준 효소 프로토콜에 비해 훨씬 적은 시간 소모이며 형광 활성화 세포 선별 분석에 일상적으로 사용되어 왔습니다.
Introduction
면역 세포가 말초 신경 손상 다음 신경 병증 통증에 기여한다는 상당한 증거가 지금있다1,2. 성숙한 대식세포를 포함하는 말초 단핵세포는 식세포증, 항원 프리젠테이션 및 사이토카인 방출을 통해 조직 손상 및 전신 감염에 반응하는 것으로 알려져 있다. 척추 등쪽 경적에서 신경 손상 유발 미세글리아 활성화와 병행하면, 등쪽 뿌리 신경절(DRG)의 대식세포도 신경 손상 후 크게 확장된다3,4. 특히, DRG5,6, 7에서감각 뉴런과 상호 작용하여 말초 신경 손상 후 대식세포가 신경 병증 성 통증 발달에 기여하는지 여부를 결정하는 관심이 증가하고 있습니다. 8개 , 9개 , 10개 , 11. 또한, 최근 연구는 또한 신경 부상 후 축 축 수선에 DRG 대식세포의 기여를 연루12,13. 또 다른 연구는 대식세포 하위 집단(즉, CD11b+Ly6Chi 및 CD11b+Ly6C저/-세포)이 기계적 과민증14에서다른 역할을 할 수 있음을 시사한다. 따라서, 신경 손상의 맥락에서 DRG 대식세포의 반응을 급속하게 phenotyping하는 것은 우리가 신경 병성 고통에 기여하는 신경면역 요인을 확인하는 것을 도울 수 있습니다.
종래, DRG에서 대식세포를 분리하는 프로토콜은 효소 소화15,16을포함하는 여러 단계를 포함한다. 이 기술은 종종 시간이 많이 걸리며 대규모 실험에 많은 비용이 들 수 있습니다. 콜라게나아제 타입 II(4 mg/mL)와 디스파스 타입 II(4.7 mg/mL)를 20분 동안 소화하는 가벼운 소화는 이전에15분동안 권장되었지만, 이 효소에 노출된 후 세포가 손상되거나 세포 사멸이 발생하기 쉽다고 생각할 수 있습니다. 항복. 또한, 배치에서 배치에 효소의 품질의 차이는 이 프로세스의 효율성에 더 영향을 미칠 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 효소 소화에 노출 된 대 식 세포 는 원치 않는 자극 될 수 있습니다 및 따라서 생체 내 상태에서 매우 다를 수 있습니다. 변경은 잠재적으로 기능적인 연구 결과의 결과를 복잡하게 할 수 있습니다.
여기에서 우리는 기계적 해리를 사용하여 4 °C에서 DRG 대식세포를 신속하게 분리하는 효소없는 프로토콜을 설명합니다. 견본은 세포 응고를 제한하기 위하여 얼음에 보관됩니다. 결과적으로, 우리의 접근은 격리의 일관성을 유지하는 이점을 제공하고, 고립 된 세포는 아마도 건강하고 덜 자극된다. 우리는 또한 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 가진 고립된 세포의 질을 검증하기 위하여 증거를 제출합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 마우스 DRG에서 분리된 대식세포를 효과적으로 풍부하게 하는 새로운 방법을 소개합니다. DRG 면역 세포를 분리하는 기존의 접근법은 효소 소화15,18을필요로하며, 이는 이제 원치 않는 세포 손상을 제한하고 수율을 높이기 위해 프로토콜에서 기계적 균질화로 대체됩니다. 따라서 새 프로토콜은 훨씬 적은 시간 소모입니다. 더 중요 한 것은, 효?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구에 의해 지원 되었다: 마 취 교육 및 연구에 대 한 재단 (XY); UCSF 마취 및 perioperative 배려의 부 (XY); 및 1R01NS100801-01(GZ). 이 연구는 NIH (P30CA082103)의 보조금을 통해 세포 분석 공유 자원 시설에 대한 HDFCCC 연구소에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
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