त्रि-आयामी एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली को-कल्चर स्फरॉइड्स का उपयोग करते हुए एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने वाले सेल और मेसेन्काइमल स्टेम सेल
Summary
त्रि-आयामी सह-संस्कृति गोलाभ एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली को शारीरिक एंजियोजेनेसिस की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। सह संस्कृति गोलभॉइड दो मानव संवहनी सेल अग्रदूतों, ईसीएफसी और एमएससी द्वारा गठित कर रहे हैं, और कोलेजन जेल में एम्बेडेड. नई प्रणाली एंजियोजेनिक न्यूनाधिक मूल्यांकन के लिए प्रभावी है, और विवो अध्ययन में अधिक प्रासंगिक जानकारी प्रदान करता है.
Abstract
एंजियोजेनेसिस के क्षेत्र में अध्ययन आक्रामक रूप से मान्यता के साथ पिछले कुछ दशकों में बढ़ रहा है कि एंजियोजेनेसिस 50 से अधिक विभिन्न रोग स्थितियों की एक पहचान है, जैसे रूमेटोइड गठिया, ऑकुलोपैथी, हृदय रोग , और ट्यूमर मेटास्टेसिस। एंजियोजेनेसिस दवा के विकास के दौरान, यह शारीरिक angiogenesis प्रक्रिया को प्रतिबिंबित करने के लिए उपयुक्त सेल प्रकार और उचित स्थितियों के साथ इन विट्रो परख प्रणालियों में उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। मुख्य रूप से endothelial कोशिकाओं का उपयोग कर विट्रो एंजियोजेनेसिस परख प्रणालियों में वर्तमान की सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एक 3 आयामी (3 डी) सह संस्कृति गोलाभ परख प्रणाली विकसित की है। सह-संस्कृति गोलभॉइड दो मानव संवहनी सेल अग्रदूतों, endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs) और mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) 5 से 1 के अनुपात के साथ द्वारा उत्पादित किया गया. ईसीएफसी + एमएससी स्फीरोइड टाइप में एम्बेडेड थे मैं कोलेजन मैट्रिक्स में विवो extracellular वातावरण की नकल करने के लिए। एक वास्तविक समय सेल रिकॉर्डर लगातार 24 एच के लिए अधोभ से एंजियोजेनिक अंकुरित की प्रगति का निरीक्षण करने के लिए उपयोग किया गया था लाइव सेल फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीक भी अंकुरित गठन के दौरान प्रत्येक सेल प्रकार के स्थानीयकरण पथ के लिए लागू किया गया था। स्प्राउट्स की संख्या की गणना करके और व्यक्तिगत स्फीरों से उत्पन्न स्प्राउट्स की संचयी लंबाई को मापने के द्वारा एंजियोजेनिक क्षमता का परिमाण निर्धारित किया गया था। पांच बेतरतीब ढंग से चयनित गोलभड़ियों प्रयोगात्मक समूह प्रति विश्लेषण किया गया. तुलना प्रयोगों से पता चला है कि ईसीएफसी + एमएससी स्रूपॉइड्स ने ईसीएफसी-केवल गोलभॉइड की तुलना में अधिक अंकुरित संख्या और संचयी अंकुरित लंबाई दिखाई। Bevacizumab, एक एफडीए को मंजूरी दे दी एंजियोजेनेसिस अवरोध करनेवाला, नव विकसित सह संस्कृति गोलाभ परख प्रणाली के साथ परीक्षण किया गया था विरोधी angiogenic दवाओं स्क्रीन करने के लिए अपनी क्षमता को सत्यापित करने के लिए. ईसीएफसी + एमएससी के लिए आईसी50 मूल्य केवल ईएफसी एस बी एस की तुलना में स्फीरोइड, जेनोग्रैफ्ट ट्यूमर माउस मॉडल से प्राप्त बेवासिजुमाब की प्रभावी प्लाज्मा एकाग्रता के करीब था। वर्तमान अध्ययन से पता चलता है कि 3 डी ईसीएफसी + एमएससी स्फीरोइड एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली शारीरिक एंजियोजेनेसिस के लिए प्रासंगिक है, और पशु प्रयोगों के अग्रिम में एक प्रभावी प्लाज्मा एकाग्रता की भविष्यवाणी कर सकते हैं।
Introduction
दुनिया भर में लगभग 500 मिलियन लोगों को संवहनी विकृति-संवारे गठिया, ऑकुलोपैथी, हृदय रोगों, और ट्यूमर मेटास्टेसिस1जैसे संवहनी विकृति-संवदेषित रोगों के लिए एंजियोजेनेसिस-मॉडुलन थेरेपी से लाभ होने की उम्मीद है। इस प्रकार, दवाओं है कि angiogenesis नियंत्रण का विकास दवा उद्योग में एक महत्वपूर्ण अनुसंधान क्षेत्र बन गया है. दवा विकास प्रक्रिया के दौरान, विवो पशु अध्ययन में शारीरिक कार्यों और अंगों के बीच प्रणालीगत बातचीत पर दवा उम्मीदवारों के प्रभाव का पता लगाने के लिए आवश्यक है। हालांकि, नैतिक और लागत मुद्दों पशु प्रयोगों2के बारे में चिंताओं में वृद्धि हुई है. इसलिए, इन विट्रो परख प्रणालियों में सुधार के लिए पशु प्रयोगों से पहले बेहतर निर्णय लेने के लिए अग्रणी अधिक सटीक और उम्मीद के मुताबिक डेटा प्राप्त करने की जरूरत है. इन विट्रो एंजियोजेनेसिस परख में आम तौर पर प्रसार को मापने, आक्रमण, प्रवास, या endothelial कोशिकाओं के ट्यूबलर संरचना गठन (ईसी) दो आयामी (2 डी) संस्कृति प्लेटों3में बीज. ये 2 डी एंजियोजेनेसिस परख त्वरित, सरल, मात्रात्मक, और लागत प्रभावी हैं, और एंजियोजेनेसिस-मॉडुलन दवाओं की खोज में महत्वपूर्ण योगदान दिया है। हालांकि, कई मुद्दों में सुधार किया जा करने के लिए रहते हैं।
इस तरह के 2 डी इन विट्रो परख प्रणालियों में एंजियोजेनेसिस की जटिल बहु-चरण घटनाओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकता जो विवो शारीरिक स्थितियों में होता है, जिससे गलत परिणाम होते हैं जो इन विट्रो परख डेटा और नैदानिक परीक्षण परिणामों के बीच विसंगतियों का कारण बनते हैं4। 2 डी संस्कृति की स्थिति भी सेलुलर phenotypes के परिवर्तन प्रेरित. उदाहरण के लिए, 2D संस्कृति प्लेटों में प्रसार के बाद, ECs एक कमजोर सेलुलर phenotype CD34 की कम अभिव्यक्ति और कई संकेत है कि सेलुलर प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित द्वारा प्रकट के रूप मेंहै 5,6. 2 डी संस्कृति आधारित एंजियोजेनेसिस परख प्रणालियों की सीमाओं को दूर करने के लिए, तीन आयामी (3 डी) गोलाभ एंजियोजेनेसिस सिस्टम विकसित किया गया है। ईसीएस द्वारा बनाए गए गोलोभों से ट्यूबलर संरचना के गठन के बाद अंकुरित होना विवो नव-संवहनी प्रक्रियाओं7,8 में प्रतिबिंबित होताहै। इस प्रकार, 3 डी स्फरॉइड एंजियोजेनेसिस परख संभावित समर्थक या विरोधी एंजियोजेनेसिस दवाओं की जांच के लिए एक प्रभावी परख प्रणाली माना गया है।
अधिकांश 3 डी गोलाभ एंजियोजेनेसिस परख केवल ईसी का उपयोग, मुख्य रूप से मानव नाभि शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECS) या मानव dermal microvascular endothelial कोशिकाओं (HDMECs) एंजियोजेनेसिस के दौरान ईसी की सेलुलर प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित करने के लिए. हालांकि, रक्त केशिकाओं दो प्रकार के सेल से बना रहे हैं: ईसी और pericytes. ईसी और pericytes के बीच द्वि-दिशात्मक बातचीत विस्तार उचित संवहनी अखंडता और समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. वंशानुगत स्ट्रोक, मधुमेह रेटिनोपैथी, और शिरापरक विकृति जैसे कई रोग, बदल पेरिसाइट घनत्व के साथ जुड़े हुए हैं या एंडोथेलियम9के प्रति पेरिसाइट लगाव में कमी आई है। पेरिसाइट्स को एंजियोजेनिक प्रक्रिया के एक प्रमुख तत्व के रूप में भी जाना जाता है। ईसी द्वारा नवगठित पोत संरचनाओं को स्थिर करने के लिए पेरिसाइट्स की भर्ती की जाती है। इस संबंध में, एक-संस्कृति स्फिरॉइड एंजियोजेनेसिस परख में परिक्षा7,10को शामिल नहीं किया गया है। इसलिए, ईसी और pericytes द्वारा गठित सह संस्कृति गोलाभ अधिक बारीकी से शारीरिक angiogenic घटनाओं की नकल करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं.
वर्तमान अध्ययन मानव endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs) और mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) के संयोजन के साथ एक 3 डी सह संस्कृति गोलाभ एंजियोजेनेसिस परख विकसित करने के उद्देश्य से और अधिक बारीकी से विवो एंजियोजेनेसिस में प्रतिबिंबित करने के लिए। एक सामान्य रक्त वाहिका के एक इन विट्रो प्रतिनिधित्व विधानसभा के रूप में सह संस्कृति गोलभॉइड प्रणाली पहली बार 200111में Korff एट अल द्वारा स्थापित किया गया था। वे HUVECs और मानव नाभि धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (HUSMCs) संयुक्त, और प्रदर्शन किया है कि दो परिपक्व संवहनी कोशिकाओं के सह संस्कृति अंकुरित क्षमता में कमी आई. परिपक्व ईसी (एचयूवीसी) उत्तरोत्तर बढ़ने और अंतर करने की अपनी क्षमता खोने के लिए जाना जाता है, जो उनके एंजियोजेनेसिस प्रतिक्रियाओं12,13को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। परिपक्व परिसंवहनी कोशिकाओं (HUSMCs) संवहनी endothelial विकास कारक (VEGF) प्रतिक्रिया11के निराकरण के माध्यम से endothelial सेल निष्क्रियता पैदा कर सकता है. Korff और हमारे सह संस्कृति गोलभॉइड प्रणाली के बीच मुख्य अंतर सेल प्रकार का इस्तेमाल किया है. हम दो संवहनी अग्रदूतों, ईसीएफसी और एमएससी लागू, स्क्रीन और समर्थक या विरोधी एंजियोजेनिक एजेंटों की जांच करने के लिए एक उचित एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली स्थापित करने के लिए। ईसीएफसी ईसीएस के अग्रदूत हैं। ईसीएफसी में परिपक्व ईसी14की तुलना में मजबूत प्रसार क्षमता है, जो ईसी की सीमा को पार करने में सक्षम है। ईसीएफसी कई प्रसवोत्तर रोग विज्ञान की स्थिति15,16,17में नए पोत निर्माण में योगदान देते हैं . एमएससी pluripotent स्टेम सेल है कि pericytes में अंतर करने की क्षमता है, जिससे एंजियोजेनेसिस18,19में योगदान कर रहे हैं.
पिछली रिपोर्टों में, ईसीएफसी और एमएससी ने विट्रो ट्यूब गठन20में , विवो नव-वास्कुलराइजेशन21,22, और इस्कीमिक ऊतकों के बेहतर रिपरफ्यूजन23,24में सहक्रियाशील प्रभाव दिखाया था . वर्तमान अध्ययन में, ईसीएफसी और एमएससी सह-संस्कृति स्फीरोइड बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक विवो 3 डी वातावरण को प्रतिबिंबित करने के लिए प्रकार मैं कोलेजन जेल में एम्बेडेड। कोलेजन को ईसीएस25के आस-पास के बाह्यकोशिक मैट्रिक्स (ईसीएम) के प्रमुख घटक के रूप में माना जाता है। ईसीएम सेल व्यवहार26को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है . यहाँ प्रस्तावित परख प्रोटोकॉल आसानी से और जल्दी से आम प्रयोगशाला तकनीकों का उपयोग कर दो दिनों के भीतर किया जा सकता है. अंकुरित प्रक्रिया के दौरान प्रभावी सेल ट्रैकिंग के लिए, प्रत्येक सेल प्रकार फ्लोरोसेंट लेबल किया जा सकता है और एक वास्तविक समय सेल रिकॉर्डर का उपयोग कर नजर रखी. नव स्थापित 3 डी सह संस्कृति गोलाभ एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली संभावित एंजियोजेनिक न्यूनाधिक मूल्यांकन के लिए संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए और विवो अध्ययन में अग्रिम में उम्मीद के मुताबिक जानकारी प्रदान करने के लिए बनाया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन में एक उन्नत इन विट्रो एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली का उपयोग करते हुए दो मानव संवहनी सेल संतति, ईसीएफसी और एमएससी द्वारा गठित सह-संस्कृति गोलाभ प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है। सह-संस्कृ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध के लिए खाद्य एवं औषधि सुरक्षा मंत्रालय से एक अनुदान (17172MFDS215), कोरिया सरकार (MSIP) (2017R1A2B4005463) द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (NRF) अनुदान, और बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से समर्थित किया गया था राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) शिक्षा मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित (2016R1A6A1A03007648).।
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
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