Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche
Summary
Il sistema di analisi dell’angiogenesi sferoide di co-cultura tridimensionale è progettato per imitare l’angiogenesi fisiologica. Gli sferoidi della co-coltura sono formati da due precursori di cellule vascolari umane, ECFC e MSC, e incorporati nel gel di collagene. Il nuovo sistema è efficace per valutare i modulatori angiogenici e fornisce informazioni più rilevanti allo studio in vivo.
Abstract
Gli studi nel campo dell’angiogenesi sono stati aggressivamente in crescita negli ultimi decenni con il riconoscimento che l’angiogenesi è un segno distintivo di più di 50 diverse condizioni patologiche, come l’artrite reumatoide, l’oculopatia, le malattie cardiovascolari e la metastasi tumorale. Durante lo sviluppo del farmaco di angiogenesi, è fondamentale utilizzare sistemi di analisi in vitro con tipi di cellule appropriate e condizioni adeguate per riflettere il processo di angiogenesi fisiologica. Per superare i limiti degli attuali sistemi di analisi dell’angiogenesi in vitro utilizzando principalmente cellule endoteliali, abbiamo sviluppato un sistema di analisi speroide a co-coltura tridimensionale (3D). Gli sferoidi della co-coltura sono stati prodotti da due precursori di cellule vascolari umane, la colonia endoteliale che forma cellule (ECFC) e le cellule staminali mesenchimale (MSC) con un rapporto di 5 a 1. Gli sferoidi ECC-MSC sono stati incorporati nella matrice del collagene di tipo I per imitare l’ambiente extracellulare in vivo. È stato utilizzato un registratore cellulare in tempo reale per osservare continuamente la progressione della germogliazione angiogenica dagli sferoidi per la tecnica di etichettatura fluorescente a cellule vive per trarre la localizzazione di ogni tipo di cellula durante la formazione del germoglio. Il potenziale angiogenico è stato quantificato contando il numero di germogli e misurando la lunghezza cumulativa dei germogli generati dai singoli sferoidi. Sono stati analizzati cinque sferoidi selezionati casualmente per gruppo sperimentale. Gli esperimenti di confronto hanno dimostrato che gli sferoidi ECFC-MSC mostravano un maggior numero di germogli e una lunghezza cumulativa del germoglio rispetto agli sferoidi solo ECFC. Bevacizumab, un inibitore dell’angiogenesi approvato dalla FDA, è stato testato con il sistema di analisi sferoide di co-cultura appena sviluppato per verificare il suo potenziale per lo screening di farmaci anti-angiogenici. Il valore IC50 per gli sferoidi ECFC rispetto agli sferoidi ecFC era più vicino all’effettiva concentrazione plasmatica di bevacizumab ottenuta dal modello murino tumorale xenotrapianto. Il presente studio suggerisce che il sistema di analisi dell’angiogenesi sferoide degli ECC-MSC 3D è rilevante per l’angiogenesi fisiologica e può prevedere un’efficace concentrazione di plasma prima degli esperimenti sugli animali.
Introduction
Si prevede che circa 500 milioni di persone in tutto il mondo beneficeranno della terapia di modulazione angiogenesi per malattie associate alla malformazione vascolare come l’artrite reumatoide, l’oculopatia, le malattie cardiovascolari e la metastasi tumorale1. Così, lo sviluppo di farmaci che controllano l’angiogenesi è diventato un importante settore di ricerca nell’industria farmaceutica. Durante il processo di sviluppo del farmaco, lo studio sugli animali in vivo è necessario per esplorare gli effetti dei farmaci candidati sulle funzioni fisiologiche e sulle interazioni sistemiche tra gli organi. Tuttavia, le questioni etiche e di costo hanno accresciuto le preoccupazioni relative agli esperimenti sugli animali2. Pertanto, sono necessari sistemi di analisi in vitro migliorati per ottenere dati più accurati e prevedibili che portino a un migliore processo decisionale prima degli esperimenti sugli animali. Gli attuali saggi di angiogenesi in vitro di solito misurano la proliferazione, l’invasione, la migrazione o la formazione di strutture tubolari di cellule endoteliali (EC) seminate in piastre di coltura bidimensionali (2D)3. Questi saggi di angiogenesi 2D sono rapidi, semplici, quantitativi e convenienti, e hanno contribuito in modo significativo alla scoperta di farmaci che modulano l’angiogenesi. Restano tuttavia da migliorare diverse questioni.
Tali sistemi di analisi in vitro 2D non possono riflettere complessi eventi a più fasi di angiogenesi che si verifica in condizioni fisiologiche in vivo, portando a risultati imprecisi che causano discrepanze tra i dati di analisi in vitro e gli esiti delle sperimentazioni cliniche4. Le condizioni di coltura 2D inducono anche il cambiamento dei fenotipi cellulari. Ad esempio, dopo la proliferazione in piastre di coltura 2D, gli EC hanno un fenotipo cellulare debole come si manifesta con l’espressione ridotta di CD34 e diversi segnali che governano le risposte cellulari5,6. Per superare i limiti dei sistemi di analisi dell’angiogenesi basata sulla cultura 2D, sono stati sviluppati sistemi di analisi dell’angiogenesi sferoide tridimensionali (3D) (3D). La germogliazione seguita dalla formazione di strutture tubolari da sferoidi formati da EC riflette i processi di neo-vascolarizzazione in vivo7,8. Così, l’angiogenesi sferoide 3D è stato considerato un sistema di analisi efficace per lo screening di potenziali farmaci pro- o anti-angiogenesi.
La maggior parte dei saggi di angiogenesi sferoide 3D utilizzano solo EC, principalmente cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) o cellule endoteliali microvascolari umane (HDMEC) per concentrarsi sulla risposta cellulare delle EC durante l’angiogenesi. Tuttavia, i capillari del sangue sono composti da due tipi di cellule: EC e periciti. L’interazione bidirezionale tra EC e periciti è fondamentale per una corretta integrità e funzione vascolare. Diverse malattie, come l’ictus ereditario, la retinopatia diabetica e la malformazione venosa, sono associate a una densità di periciti alterata o a una diminuzione dell’attaccamento pericito all’endotelio9. I periciti sono anche noti come un elemento chiave del processo angiogenico. I periciti vengono reclutati per stabilizzare le strutture delle navi di nuova formazione da parte dei PEC. A questo proposito, l’angiogenesi degli sferoidi monocoltura non incorpora periciti7,10. Pertanto, gli sferoidi di co-cultura formati da EC e periciti possono fornire un approccio prezioso per imitare più da vicino gli eventi angiogenici fisiologici.
Il presente studio mirava a sviluppare un test di angiogenesi sferida di co-cultura 3D con una combinazione di cellule formanti cellule di colonia endoteliale umana (ECFC) e cellule staminali mesenchiche (MSC) per riflettere più da vicino l’angiogenesi in vivo. Il sistema sferoide di co-cultura come assemblaggio rappresentazione in vitro di un normalevaso sanguigno è stato istituito per la prima volta da Korff et al. Hanno combinato HUVEC e cellule muscolari lisce dell’arteria ombelicale umana (HUSMC), e hanno dimostrato che la co-cultura di due cellule vascolari mature ha diminuito il potenziale di germogliazione. ECs maturi (HUVEC) sono noti per perdere progressivamente la loro capacità di proliferare e differenziare, che influenza negativamente le loro risposte di angiogenesi12,13. Le cellule perivascolari mature (HUSMC) possono causare l’inattivazione delle cellule endoteliali attraverso l’abrogazione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) reattività11. La differenza principale tra Korff e il nostro sistema di sferoide co-culturale è il tipo di cellule utilizzate. Abbiamo applicato due precursori vascolari, ECFC e MSC, per stabilire un sistema di analisi dell’angiogenesi appropriato per lo screening e l’indagine degli agenti pro-o-anti-angiogenici. Gli ECFC sono il precursore degli EC. Gli ECFC hanno una solida capacità di proliferazione rispetto ai14EC maturi, che consentono di superare la limitazione delle EC. Gli ECFC contribuiscono alla formazione di nuovi vasi in molte condizioni patofisiologiche postnatali15,16,17. Le MSC sono cellule staminali pluripotenti che hanno la capacità di differenziarsi in periciti, contribuendo così all’angiogenesi18,19.
Nei rapporti precedenti, ECFC e MSC hanno mostrato effetti sinergici sulla formazione di tubi in vitro20, in vivo neo-vascolarizzazione21,22, e una migliore riperfusione dei tessuti ischemici23,24. Nel presente studio, ECFC e MSC sono stati utilizzati per formare sferoidi di co-cultura e incorporati nel gel di collagene di tipo I per riflettere un ambiente 3D in vivo. Il collagene è considerato come uno dei principali costituenti della matrice extracellulare (ECM) che circonda gli EC25. L’ECM svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del comportamento cellulare26. Il protocollo di analisi qui proposto può essere eseguito facilmente e rapidamente entro due giorni utilizzando tecniche di laboratorio comuni. Per un monitoraggio efficace delle celle durante il processo di germogliazione, ogni tipo di cellula può essere etichettato e monitorato in modo fluorescente utilizzando un registratore di celle in tempo reale. Il nuovo sistema di analisi degli sferoidi di cocultura 3D è progettato per aumentare la sensibilità per valutare i potenziali modulatori angiogenici e per fornire informazioni prevedibili prima dello studio in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente studio introduce un sistema di analisi dell’angiogenesi in vitro migliorato utilizzando sferoidi di co-coltura formati da due progenitori di cellule vascolari umane, ECFC e MSC. Il sistema sferoide co-cultura può imitare la formazione di germogli vascolari in vivo, l’interazione e l’incorporazione tra cellule endoteliali e periciti. Rispetto ad altri saggi di angiogenesi in vitro che riflettono solo l’angiogenesi mediata dalle EC, questo sistema di analisi co-culturale è più rappresentativo della cascata m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione (17172MFDS215) del Ministero della sicurezza alimentare e della droga, dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea(NRF) finanziata dal governo coreano (MSIP) (2017R1A2B4005463) e dal Basic Science Research Program attraverso il National Research Foundation of Korea (NRF) finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
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