نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal
Summary
تم تصميم نظام فحص تكوين الأوعية الدموية ثلاثي الأبعاد للزراعة الوعائية لمحاكاة تكوين الأوعية الفسيولوجية. يتم تشكيل spheroids الثقافة المشتركة من قبل اثنين من السلائف خلايا الأوعية الدموية البشرية، ECFCs وMSCs، وجزءا لا يتجزأ من هلام الكولاجين. النظام الجديد فعال لتقييم المغيرات الوعائية، ويوفر معلومات أكثر صلة للدراسة في الجسم الحي.
Abstract
وقد نمت الدراسات في مجال تكوين الأوعية الدموية بقوة في العقود القليلة الماضية مع الاعتراف بأن تكوين الأوعية الدموية هو السمة المميزة لأكثر من 50 حالة مرضية مختلفة، مثل التهاب المفاصل الروماتويدي، اعتلال العين، وأمراض القلب والأوعية الدموية ، وورم خبيث. أثناء تطوير عقار تكوين الأوعية، من الضروري استخدام أنظمة الاختبار في المختبر مع أنواع الخلايا المناسبة والظروف المناسبة لتعكس عملية تكوين الأوعية الفسيولوجية. للتغلب على القيود المفروضة على أنظمة فحص تكوين الأوعية الدموية الحالية في المختبر باستخدام الخلايا البطانية بشكل رئيسي، قمنا بتطوير نظام فحص ثنائي الشعر ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للزراعة المشتركة. تم إنتاج البشيرويدات ذات الثقافة المشتركة من قبل اثنين من سلائف الخلايا الوعائية البشرية، والخلايا المكونة للمستعمرة البطانية (ECFCs) والخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) بنسبة 5 إلى 1. تم تضمين ECFCs + MSCs spheroids في مصفوفة الكولاجين من النوع الأول لتقليد البيئة خارج الخلية في الجسم الحي. وقد استخدم مسجل خلية في الوقت الحقيقي لمراقبة تطور الأوعية الدموية تنبت باستمرار من النثيرات لمدة 24 ساعة. تم قياس الإمكانات الوعائية من خلال حساب عدد البراعم وقياس الطول التراكمي للبراعم المتولدة من النفيض الفردية. تم تحليل خمسة spheroids مختارة عشوائيا لكل مجموعة تجريبية. وأظهرت تجارب المقارنة أن مركبات الكربون الكلورية فلورية + مركبات الكربون الكلورية فلورية أظهرت عدداً أكبر من البراعم وطولاً تراكمياً للبراعم مقارنة بمركبات الكربون الكلورية فلورية فقط. تم اختبار Bevacizumab، وهو مثبط للتكوين الأوعية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير، مع نظام الفحص بزراعة مشتركة تم تطويره حديثًا للتحقق من قدرته على فحص الأدوية المضادة للأوعية. وكانت القيمةIC 50 لمركبات الكربون الكلورية فلورية + MSCs spheroids بالمقارنة مع spheroids ECFCs فقط أقرب إلى تركيز البلازما الفعال من bevacizumab التي تم الحصول عليها من نموذج الماوس الورم xenograft. وتشير هذه الدراسة إلى أن نظام فحص تكوين الأوعية الجيوعية ثلاثي المفعول ECFCs+MSCs له صلة بتكوين الأوعية الفيزيولوجي، ويمكنه التنبؤ بتركيز فعال للبلازما قبل إجراء التجارب الحيوانية.
Introduction
ومن المتوقع أن يستفيد ما يقرب من 500 مليون شخص في جميع أنحاء العالم من العلاج بتحوير الأوعية الدموية للأمراض المرتبطة بتشوه الأوعية الدموية مثل التهاب المفاصل الروماتويدي، واعتلال الأوعية الدموية، وأمراض القلب والأوعية الدموية، وورم خبيث1. وهكذا، أصبح تطوير الأدوية التي تتحكم في تكوين الأوعية مجالا هاما للبحوث في صناعة الأدوية. خلال عملية تطوير المخدرات، في دراسة الحيوان في الجسم الحي ضروري لاستكشاف آثار المرشحين المخدرات على وظائف الفيزيولوجية والتفاعلات النظامية بين الأجهزة. ومع ذلك، فإن القضايا الأخلاقية والتكاليف قد زادت من المخاوف المتعلقة بالتجارب الحيوانية2. ولذلك، هناك حاجة إلى تحسين نظم الاختبار في المختبر للحصول على بيانات أكثر دقة ويمكن التنبؤ بها مما يؤدي إلى اتخاذ قرارات أفضل قبل التجارب الحيوانية. عادة ما تقيس اختبارات تكوين الأوعية الدموية في المختبر عادة الانتشار أو الغزو أو الهجرة أو تشكيل البنية الأنبوبية للخلايا البطانية (ECs) المصنفة في لوحات ثقافة ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد)3. هذه الاختبارات الأنجية 2D سريعة وبسيطة وكمية وفعالة من حيث التكلفة، وقد ساهمت بشكل كبير في اكتشاف الأدوية الأنبية تحوير. ومع ذلك، لا يزال يتعين تحسين عدة مسائل.
مثل هذه الأنظمة اختبار في المختبر لا يمكن أن تعكس الأحداث المعقدة متعددة الخطوات من تكوين الأوعية الدموية التي تحدث في الظروف الفسيولوجية الحية، مما يؤدي إلى نتائج غير دقيقة التي تسبب الاختلافات بين بيانات الاختبار في المختبر ونتائج التجارب السريرية4. ظروف الثقافة 2D أيضا الحث على تغيير الأنماط الظاهرية الخلوية. على سبيل المثال، بعد الانتشار في لوحات الثقافة 2D، ECs لديها النمط الظاهري الخلوي ضعيفة كما يتجلى في انخفاض التعبير من CD34 والعديد من الإشارات التي تحكم الاستجابات الخلوية5،6. للتغلب على القيود المفروضة على أنظمة فحص تكوين الأوعية الدموية المستندة إلى الثقافة 2D، تم تطوير أنظمة اختبار تكوين الأوعية الوعائية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). تنبت تليها تشكيل بنية أنبوبي من spheroids التي شكلتها ECs تعكس في عمليات الأوعية الدموية الجديدة في الجسم الحي7،8. وهكذا، فإن الفحص الأوعية الوعائية ثلاثية المفعول يعتبر نظاماً فعالاً لفحص الأدوية المحتملة المؤيدة أو المضادة للأوعية الدموية.
معظم الاختبارات الأنجية السفيرة 3D تستخدم فقط ECs، أساسا الخلايا البطانية الوريد السري البشري (HUVECs) أو الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة الجلدية البشرية (HDMECs) للتركيز على الاستجابة الخلوية من ECs أثناء تكوين الأوعية الدموية. ومع ذلك، تتكون الشعيرات الدموية الشعرية من نوعين من الخلايا: ECs وpericytes. إن وضع تفاعل ثنائي الاتجاه بين ECs وpericytes أمر بالغ الأهمية لسلامة الأوعية الدموية السليمة ووظيفتها. ترتبط العديد من الأمراض، مثل السكتة الدماغية الوراثية، اعتلال الشبكية السكري، والتشوه الوريدي، مع كثافة pericyte المتغيرة أو انخفاض التعلق pericyte إلى البطانة9. ومن المعروف أيضا Pericytes كعنصر رئيسي في عملية الأوعية. يتم تعيين Pericytes لتحقيق الاستقرار هياكل السفن التي شكلت حديثا من قبل اللجان البيئية. في هذا الصدد، أحادية الثقافة spheroid الأوعية الدموية لا يتضمن البيريسيس7،10. ولذلك، فإن الـ spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها ECs وpericytes قد توفر نهجا قيما لتقليد الأحداث الوعائية الفيزيولوجية بشكل أوثق.
تهدف هذه الدراسة إلى تطوير فحص الأوعية الجيوعية ية الشفيرة المشتركة ثلاثية الدناق مع مزيج من الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية البشرية (ECFCs) والخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) لتعكس بشكل أوثق في تكوين الأوعية الحية. تم تأسيس نظام spheroid الثقافة المشتركة كتجميع التمثيل في المختبر من الأوعية الدموية العادية لأول مرة من قبل Korff وآخرون في عام 200111. أنها الجمع بين HUVECs وخلايا العضلات الملساء الشريان السري البشري (HUSMCs)، وأظهرت أن الثقافة المشتركة لخليتين الأوعية الدموية الناضجة خفضت من إمكانات تنبت. ومن المعروف أن ECs ناضجة (HUVECs) تفقد تدريجيا قدرتها على التكاثر والتفريق، مما يؤثر سلبا على استجابات ها الأوعية الدموية12،13. الخلايا الناضجة المحيطة بالأوعية الدموية (HUSMCs) يمكن أن تسبب تعطيل الخلايا البطانية من خلال إلغاء عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) استجابة11. الفرق الرئيسي بين Korff ونظام نا spheroid الثقافة المشتركة هو أنواع الخلايا المستخدمة. وقد طبقنا سلائف الأوعية الدموية، وهما مركبات الكربون الكلورية فلورية ومركبات الكربون الكلورية فلورية وأجهزة التصلب العصبي المتعدد، لإنشاء نظام سليم لفحص تكوين الأوعية الدموية لفحص العوامل المؤيدة أو المضادة للأوعية الدموية والتحقيق فيها. ومركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية هي مقدمة مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. وتتمتع مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية بقدرة قوية على الانتشار مقارنة بالبلدان الـ14الناضجة، التي تمكن من التغلب على الحد من الـ ECs. تساهم مركبات الكربون الكلورية فلورية في تكوين سفن جديدة في العديد من الظروف الفيزيولوجية المرضية بعد الولادة15و16و17. MSCs هي الخلايا الجذعية متعددة القوى التي لديها القدرة على التمييز إلى pericytes، وبالتالي المساهمة في تكوين الأوعية الدموية18،19.
في التقارير السابقة، أظهرت مركبات الكربون الكلورية فلورية وMSCs آثار التآزر على تشكيل أنبوب في المختبر20، في الجسم الحي الأوعية الدموية الجديدة21،22، وتحسين إعادة ضخ الأنسجة الإقفارية23،24. وفي هذه الدراسة، استُخدمت مركبات الكربون الكلورية فلورية والمركبات الصغيرة والمتوسطة لتشكيل الـ spheroids للثقافة المشتركة وجزءاً لا يتجزأ من جل الكولاجين من النوع الأول ليعكس بيئة ثلاثية المدة في الجسم الحي. ويعتبر الكولاجين كمكونات رئيسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM) المحيطة ECs25. يلعب ECM دورًا حاسمًا في تنظيم سلوك الخلايا26. ويمكن تنفيذ بروتوكول الفحص المقترح هنا بسهولة وسرعة في غضون يومين باستخدام تقنيات مختبرية مشتركة. لتتبع الخلايا الفعالة خلال عملية تنبت، يمكن تسمية كل نوع خلية بشكل فلورسنت ورصدها باستخدام مسجل الخلية في الوقت الحقيقي. تم تصميم نظام فحص تكوين الأوعية الوعائية المزدوج ة 3D المنشأ حديثًا لزيادة الحساسية لتقييم المغيرات الوعائية المحتملة وتوفير معلومات يمكن التنبؤ بها قبل الدراسة في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الدراسة نظام فحص تكوين الأوعية الدموية المحسن في المختبر باستخدام spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها اثنين من الذرية الخلايا الوعائية البشرية، ومركبات الكربون الكلورية فلورية وMSCs. التي يتم إنجازها من خلال التفاعل والدمج بين الخلايا البطانية وpericytes. بالمقارنة مع غيرها من الاختب?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث بمنحة (17172MFDS215) من وزارة سلامة الأغذية والأدوية، ومنحة مؤسسة البحوث الوطنية الكورية (NRF) الممولة من حكومة كوريا (MSIP) (2017R1A2B4005463)، وبرنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال مؤسسة البحوث الوطنية في كوريا (NRF) بتمويل من وزارة التعليم (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
- Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
- Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
- Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
- Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
- Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
- Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
- Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
- Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
- Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
- Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
- Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).
