使用由内皮结肠形成细胞和间质干细胞形成的共培养球体的三维血管生成测定系统

Summary

三维共培养球形血管生成测定系统设计用于模拟生理血管生成。共培养球体由两个人类血管细胞前体ECFC和MSCs组成，并嵌入胶原蛋白凝胶中。新系统对血管生成调节器的评估是有效的，为体内研究提供了更多的相关信息。

Abstract

在过去的几十年中，血管生成领域的研究一直在积极增长，人们认识到血管生成是50多种病理疾病的标志，如风湿性关节炎、神经病、心血管疾病，和肿瘤转移。在血管生成药物开发过程中，使用具有适当细胞类型和适当条件的体外测定系统以反映生理血管生成过程至关重要。为了克服目前主要使用内皮细胞的体外血管生成测定系统的局限性，我们开发了一种三维（3D）共培养球体发芽测定系统。共培养球体由两个人类血管细胞前体，内皮菌群形成细胞（ECFCs）和间质干细胞（MSCs）产生，比例为5比1。ECFCs_MSCs球体被嵌入到I型胶原蛋白基质中，以模拟体内细胞外环境。利用实时细胞记录仪连续观察24小时从球体发散血管生成过程，还应用了活细胞荧光标记技术，用于在发芽形成过程中处理每种细胞类型的定位。血管生成电位通过计算芽的数量和测量从单个球体产生的芽的累积长度来量化。每个实验组对五个随机选择的球体进行了分析。比较实验表明，与仅E氟氯化碳的球体相比，ECFCs_MSCs球体具有更大的发芽数和累积发芽长度。Bevacizumab，一种FDA批准的血管生成抑制剂，与新开发的共培养球形检测系统进行了测试，以验证其筛选抗血管生成药物的潜力。与仅ECFCs球体相比，ECFCs_MSCs球体的IC₅₀值更接近于从异种移植肿瘤小鼠模型获得的bevacizumab的有效血浆浓度。本研究表明，3D ECFCs_MSCs球形血管生成测定系统与生理血管生成有关，可在动物实验前预测有效的血浆浓度。

Introduction

全世界约有5亿人有望受益于血管畸形相关疾病的血管生成调节疗法，如风湿性关节炎、神经病、心血管疾病和肿瘤^转移1。因此，控制血管生成的药物的开发已成为制药业的一个重要研究领域。在药物开发过程中，有必要在体内进行动物研究，以探讨候选药物对生理机能和器官间系统相互作用的影响。然而，伦理和成本问题增加了对^{动物实验2}的关注。因此，需要改进体外测定系统，以获得更准确和可预测的数据，从而在动物实验前做出更好的决策。目前的体外血管生成测定通常测量在二维（2D）培养^板3中播种的内皮细胞（ECs）的增殖、入侵、迁移或管状结构形成。这些2D血管生成测定快速、简单、定量、经济高效，为发现血管生成调节药物做出了重大贡献。然而，仍有若干问题有待改进。

这种2D体外检测系统不能反映在体内生理条件下发生的血管生成的复杂多步骤事件，导致不准确的结果，导致体外测定数据与临床试验^结果4之间的差异。2D培养条件也诱发细胞表型的变化。例如，在二维培养板中增殖后，EC 具有弱细胞表型，表现为 CD34 表达减少和控制细胞响应^5、6的几个信号。为了克服基于2D培养的血管生成测定系统的局限性，开发了三维（3D）球形血管生成测定系统。发芽后，由EC形成的球体形成管状结构，反映了体内新血管化^{过程7、8。}因此，3D球形血管生成测定被认为是一种有效的检测系统，用于筛选潜在的亲或抗血管生成药物。

大多数 3D 球形血管生成测定仅利用 EC，主要是人类脐带静脉内皮细胞 （HUVECs） 或人类皮下微血管内皮细胞 （HDMECs）， 专注于血管生成期间 EC 的细胞反应。然而，血毛细血管由两种细胞类型组成：EC和围细胞。阐述EC和围细胞之间的双向相互作用对于正确的血管完整性和功能至关重要。几种疾病，如遗传性中风，糖尿病视网膜病变，和静脉畸形，都与改变的围观密度或减少的内皮依不舍的附着性附件9^相关。围卵体也被称为血管生成过程的关键元素。由EC招募围冰船以稳定新形成的船舶结构。在这方面，单培养球形血管生成测定不包括围^{细胞7，10。}因此，由EC和围细胞形成的共培养球体可能为更密切地模拟生理血管生成事件提供有价值的方法。

本研究旨在开发一种3D共培养球形血管生成测定，结合人类内皮菌群形成细胞（ECFCs）和中位体干细胞（MSCs），以更密切地反映体内血管生成。共培养球体系统作为正常血管的体外表示组装，由Korff等人于2001年建立。他们将HUVECs和人类脐带动脉平滑肌细胞（HUSMC）结合，并证明两个成熟血管细胞的共同培养降低了发芽潜力。众所周知，成熟的ECs（HUVECs）会逐渐失去增殖和分化的能力，这对其血管生成^{反应12、13}产生负面影响。成熟的血管细胞（HUSMC）可以通过废除血管内皮生长因子（VEGF）反应^能力11导致内皮细胞失活。Korff 和我们的共培养球形系统的主要区别是所使用的细胞类型。我们应用了两种血管前体，ECFC和MSCs，以建立一个适当的血管生成测定系统，以筛选和调查亲或抗血管原药。氟氯烃是氟氯化碳的前身。与^{成熟的EC14}相比，氟氯烃具有强大的扩散能力，能够克服EC的限制。在产后病理生理条件下，氟氯烃有助于新血管^的形成。MSCs是多能干细胞，具有分化成围细胞的能力，从而有助于血管^{生成18，19。}

在以前的报告中，ECFCs和MSCs对体外管^形成20、体内新血管^化21、22以及缺血^{组织23、24}的改善再灌注表现出协同效应。在本研究中，ECFC和MSCs被用来形成共培养球体，并嵌入I型胶原凝胶中，以反映体内的3D环境。胶原蛋白被认为是^围绕ECs25的细胞外基质（ECM）的主要成分。ECM在调节细胞^行为26中起着关键作用。这里提出的测定方案可以使用通用实验室技术在两天内轻松快速地执行。为了在发芽过程中进行有效的细胞跟踪，可以使用实时细胞记录器对每种细胞类型进行荧光标记和监测。新建立的3D共培养球形血管生成测定系统旨在提高评估潜在血管生成调节器的灵敏度，并在体内研究之前提供可预测的信息。

Protocol

人类氟氯烃与人类外周血分离，如27日的报告所述。简单地说，单核细胞层使用Ficoll-Paque Plus从整个血液中分离出来，并在适当的培养基培养，直到内皮状菌落出现。收集菌落，并使用CD31涂层磁珠分离ECFC。MSCs从人类成人骨髓的粘附单核细胞（MNC）部分中分离出来。研究协议获得杜松女子大学机构审查委员会（IRB No. 2017-002-01）的批准。 1. 细胞培养 <st…

Representative Results

比较实验使用单培养球体（仅限氟氯烃）和共培养球体（ECFCs_MSCs）进行，以检查MSC在氟氯化碳介导的血管生成中是否发挥相当大的作用。实时细胞记录器监测了每个球体的发芽形成24小时，可以捕获从球体中产生血管生成的过程。血管生成电位通过计算芽的数量和测量从单个球体产生的芽的累积长度来量化。对每个实验组随机选择的5个球体进行了分析。对于ECFCs_MSCs球体，发芽数量和累积发芽长?…

Discussion

本研究采用一种利用两个人类血管细胞祖体、ECFC和MSCs共同培养球体的体外血管生成测定系统改进，共培养球体系统可以模拟体内血管芽的形成，即通过内皮细胞和围细胞之间的相互作用和结合来完成。与其他仅反映ECs介导血管生成的其他体外血管生成测定相比，这种共培养性检测系统更代表生理血管生成多步级联，包括细胞相互作用、发芽、管形成、和船舶成熟。这种新建立的测定系统也类似?…

Materials

0.05 % Trypsin EDTA (1X)	Gibco	25300-054
Bevacizumab	Roche	NA	Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium	Gibco	11885-084	DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X)	Gibco	21600-010	PBS (10X)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X)	Corning	21-031-CVR	PBS (1X)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit	Promocell	C-22121	ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS)	Atlas	FP-0500A	FBS
Gelatin	BD Sciences	214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin	Gibco	10378-016	GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2	Promocell	C-28009	MSCGM-2
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	MINI67	PKH67
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Type I collagen gel	Corning	354236
Vascular endothelial growth factor A	R&D	293-VE-010	VEGF