Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden
Summary
Das dreidimensionale Co-Kultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System wurde entwickelt, um die physiologische Angiogenese nachzuahmen. Co-Kultur-Sphäroide werden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet und in Kollagengel eingebettet. Das neue System ist wirksam für die Bewertung angiogener Modulatoren und liefert relevantere Informationen für die in vivo-Studie.
Abstract
Studien auf dem Gebiet der Angiogenese haben in den letzten Jahrzehnten aggressiv zugenommen, mit der Erkenntnis, dass Angiogenese ein Kennzeichen von mehr als 50 verschiedenen pathologischen Erkrankungen ist, wie rheumatoide Arthritis, Okulopathie, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Tumormetastasen. Während der Entwicklung von Angiogenese-Medikamenten ist es entscheidend, In-vitro-Assay-Systeme mit geeigneten Zelltypen und geeigneten Bedingungen zu verwenden, um den physiologischen Angiogenese-Prozess widerzuspiegeln. Um die Einschränkungen der aktuellen In-vitro-Angiogenese-Assay-Systeme mit hauptsächlich Endothelzellen zu überwinden, haben wir ein dreidimensionales (3D) Co-Kultur-Sphäroid-Sprossen-Assay-System entwickelt. Co-Kultur-Sphäroide wurden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, endotheliaalen koloniebildenden Zellen (EFCCs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) mit einem Verhältnis von 5 zu 1 hergestellt. EFCCs+MSCs Sphäroide wurden in die Kollagenmatrix typ I eingebettet, um die extrazelluläre In-vivo-Umgebung nachzuahmen. Ein Echtzeit-Zellrekorder wurde verwendet, um kontinuierlich das Fortschreiten des angiogenen Keimens von Sphäroiden für 24 h zu beobachten. Live-Zell-Fluoreszenz-Etikettierungstechnik wurde auch angewendet, um die Lokalisation jedes Zelltyps während der Sprossenbildung zu traktieren. Das angiogene Potential wurde quantifiziert, indem die Anzahl der Sprossen gezählt und die kumulative Länge der aus den einzelnen Sphäroiden erzeugten Sprossen gemessen wurde. Pro Versuchsgruppe wurden fünf zufällig ausgewählte Sphäroide analysiert. Vergleichsexperimente zeigten, dass EFCCs+MSCs Spheroide eine höhere Sprossenzahl und kumulative Sprossenlänge zeigten als EFCCs-Sphäroide. Bevacizumab, ein von der FDA zugelassener Angiogenese-Hemmer, wurde mit dem neu entwickelten Co-Culture-Sphäroid-Assay-System getestet, um sein Potenzial zur Untersuchung antiangiogener Medikamente zu überprüfen. Der IC50-Wert für EFCCs+MSCs-Sphäroide im Vergleich zu den EFCCs-Sphäroiden war näher an der effektiven Plasmakonzentration von Bevacizumab, die aus dem Xenograft-Tumor-Mausmodell gewonnen wurde. Die vorliegende Studie legt nahe, dass das Sphäroid-Angiogenese-Assay-System von 3D-EFCCs+MSCs für die physiologische Angiogenese relevant ist und eine effektive Plasmakonzentration im Vorfeld von Tierversuchen vorhersagen kann.
Introduction
Es wird erwartet, dass weltweit rund 500 Millionen Menschen von einer angiogenesemodulierenden Therapie bei vaskulären Fehlbildungen wie rheumatoider Arthritis, Okulopathie, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Tumormetastasen profitieren1. So ist die Entwicklung von Medikamenten, die die Angiogenese kontrollieren, zu einem wichtigen Forschungsgebiet in der pharmazeutischen Industrie geworden. Während des Arzneimittelentwicklungsprozesses ist eine in-vivo-Tierstudie notwendig, um die Auswirkungen von Wirkstoffkandidaten auf physiologische Funktionen und systemische Wechselwirkungen zwischen Organen zu untersuchen. Ethische und Kostenfragen haben jedoch die Bedenken in Bezug auf Tierversuche verstärkt2. Daher sind verbesserte In-vitro-Assay-Systeme erforderlich, um genauere und berechenbarere Daten zu erhalten, die zu einer besseren Entscheidungsfindung vor Tierversuchen führen. Aktuelle In-vitro-Angiogenese-Assays messen in der Regel proliferations-, Invasions-, Migrations- oder tubuläre Strukturbildung von Endothelzellen (ECs), die in zweidimensionalen (2D) Kulturplattengesätsind 3 . Diese 2D-Angiogenese-Assays sind schnell, einfach, quantitativ und kostengünstig und haben wesentlich zur Entdeckung von Angiogenese-modulierenden Medikamenten beigetragen. Einige Fragen müssen jedoch noch verbessert werden.
Solche 2D-In-vitro-Assay-Systeme können keine komplexen mehrstufigen Ereignisse der Angiogenese widerspiegeln, die in in vivo physiologischen Bedingungen auftreten, was zu ungenauen Ergebnissen führt, die Diskrepanzen zwischen In-vitro-Assay-Daten und klinischen Studienergebnissen verursachen4. 2D-Kulturbedingungen induzieren auch die Veränderung der zellulären Phänotypen. Zum Beispiel haben ECs nach der Proliferation in 2D-Kulturplatten einen schwachen zellulären Phänotyp, der sich durch eine reduzierte Expression von CD34 und mehrere Signale manifestiert, die die zellulären Antworten steuern5,6. Um die Grenzen von 2D-Kultur-basierten Angiogenese-Assay-Systemen zu überwinden, wurden dreidimensionale (3D) Sphäroid-Angiogenese-Assay-Systeme entwickelt. Sprouting gefolgt von röhrenförmiger Strukturbildung aus Sphäroiden, die von ECs gebildet werden, reflektieren in vivo Neovaskularisationsprozesse7,8. So wurde der 3D-Sphäroid-Angiogenese-Assay als wirksames Assay-System zum Screening potenzieller Pro- oder Anti-Angiogenese-Medikamente betrachtet.
Die meisten 3D-Sphäroid-Angiogenese-Assays verwenden nur ECs, hauptsächlich menschliche Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVECs) oder menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs), um sich auf die zelluläre Reaktion von ECs während der Angiogenese zu konzentrieren. Die Blutkapillaren bestehen jedoch aus zwei Zelltypen: ECs und Pericyten. Die Ausarbeitung einer bidirektionalen Interaktion zwischen ECs und Pericyten ist entscheidend für die richtige Gefäßintegrität und -funktion. Mehrere Krankheiten, wie erblicher Schlaganfall, diabetische Retinopathie und venöse Fehlbildung, sind mit veränderter Pericytdichte oder verminderter Pericyt-Anhaftung an das Endothel9verbunden. Pericyten sind auch als Schlüsselelement des angiogenen Prozesses bekannt. Perizyten werden rekrutiert, um neu gebildete Gefäßstrukturen durch ECs zu stabilisieren. In dieser Hinsicht enthält Mono-Kultur Sphäroid Angiogenese Assay keine Pericyten7,10. Daher können Co-Kultur-Sphäroide, die durch ECs und Pericyte gebildet werden, einen wertvollen Ansatz bieten, um physiologische angiogene Ereignisse genauer nachzuahmen.
Die vorliegende Studie zielte darauf ab, einen 3D-Kokultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay mit einer Kombination von humanen endotheliaalen Koloniebildenden Zellen (EFCKw) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) zu entwickeln, um die In-vivo-Angiogenese genauer widerzuspiegeln. Das Co-Kultur-Sphäroidsystem als In-vitro-Repräsentationsassembly eines normalen Blutgefäßes wurdeerstmals 2001 von Korff et al. gegründet. Sie kombinierten HUVECs und menschliche Nabelarterie glatte Muskelzellen (HUSMCs), und zeigten, dass die Kokultur von zwei reifen Gefäßzellen das Keimpotenzial verringerte. Reife ECs (HUVECs) sind dafür bekannt, nach und nach ihre Fähigkeit zu vermehren und zu differenzieren, was sich negativ auf ihre Angiogenese-Antworten auswirkt12,13. Reife perivaskuläre Zellen (HUSMCs) können eine Endothelzellinaktivierung durch Abrogation des vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktors (VEGF) anregung11verursachen. Der Hauptunterschied zwischen Korffs und unserem Co-Kultur-Sphäroidsystem sind die verwendeten Zelltypen. Wir wandten zwei vaskuläre Vorläufer, EFCKw und MSCs, an, um ein geeignetes Angiogenese-Assay-System zu etablieren, um pro-oder-antiangiogene Wirkstoffe zu untersuchen und zu untersuchen. Die EFC-Staaten sind die Vorläufer von ECs. Die EFCKW verfügen über eine robuste Proliferationskapazität im Vergleich zu ausgereiften ECs14, die es ermöglichen, die Begrenzung der ECs zu überwinden. EFCKW tragen zu einer neuen Gefäßbildung unter vielen postnatalen pathophysiologischen Erkrankungenbei 15,16,17. MSCs sind pluripotente Stammzellen, die in pericyte differenzieren können und so zur Angiogenesebeitragen 18,19.
In früheren Berichten zeigten EFCCs und MSCs synergistische Effekte auf die In-vitro-Rohrbildung20, in vivo Neo-Vaskularisation21,22und verbesserte Reperfusion von ischämischen Geweben23,24. In der vorliegenden Studie wurden EFCCs und MSCs verwendet, um Co-Kultur-Sphäroide zu bilden und in Kollagengel Typ I eingebettet, um eine in vivo 3D-Umgebung widerzuspiegeln. Kollagen gilt als hauptbestandteil der extrazellulären Matrix (ECM) um ECs25. Das ECM spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Zellverhaltens26. Das hier vorgeschlagene Assay-Protokoll kann innerhalb von zwei Tagen mit gängigen Labortechniken einfach und schnell durchgeführt werden. Für eine effektive Zellverfolgung während des Keimvorgangs kann jeder Zelltyp mit einem Echtzeit-Zellrecorder fluoreszierend beschriftet und überwacht werden. Das neu eingerichtete 3D-Cokultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System wurde entwickelt, um die Empfindlichkeit für die Bewertung potenzieller angiogener Modulatoren zu erhöhen und vorher im Vorfeld der in vivo-Studie vorhersagbare Informationen bereitzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorliegende Studie führt ein verbessertes In-vitro-Angiogenese-Assay-System ein, das Co-Kultur-Sphäroide verwendet, die von zwei menschlichen Vaskulärenvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet werden. Durch Wechselwirkung und Einbeziehung zwischen Endothelzellen und Pericyten erreicht. Im Vergleich zu anderen In-vitro-Angiogenese-Assays, die nur die von ECs vermittelte Angiogenese widerspiegeln, ist dieses Co-Kultur-Assay-System repräsentativer für die mehrstufige Kaskade der physiologischen Angiogenese, einschlie?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch ein Stipendium (17172MFDS215) des Ministeriums für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit, die von der koreanischen Regierung (MSIP) (2017R1A2B4005463) und dem Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) finanziert vom Bildungsministerium (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
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