3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal
Summary
מערכת שיתוף התרבות התלת-ממדית של החברה מיועדת לחקות את האנגיוגנזה הפיזיולוגי. שיתוף תרבות הספרואידים נוצרות על ידי שני מקדים האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs, ו מוטבע ג’ל קולגן. המערכת החדשה יעילה להערכת מאפטורים מאופגנטיים, ומספקת מידע רלבנטי יותר למחקר בvivo.
Abstract
מחקרים בתחום האנגיוגנזה גדלו באגרסיביות בעשורים האחרונים עם ההכרה שאנגיוגנזה הוא סימן ההיכר של יותר מ-50 מצבים פתולוגיים שונים, כגון דלקת מפרקים שגרונית, מחלות לב וכלי דם. , גרורות גידול. במהלך פיתוח התרופה לאנגיוגנזה, חיוני להשתמש במערכות של שיטות חוץ-גופית עם סוגי תאים מתאימים ותנאים נאותים כדי לשקף את תהליך האנגיוגנזה הפיזיולוגי. כדי להתגבר על המגבלות הנוכחיות של המערכות הקיימות במערכת השימוש בתאי האנגיוגנזה בעיקר, פיתחנו תלת מימדי (3D) שיתוף תרבות מערכת שיטת העיבוד. שיתוף תרבות הספרואידים הופקו על ידי שני תאים אנושיים בתאי כלי דם, המושבה אנדותל היוצרים תאים (ECFCs) ו-mesenchymal תאים גזע (MSCs) עם יחס של 5 אל 1. ECFCs + MSCs spheroids הוטבעו לסוג אני קולגן מטריצה כדי לחקות את הסביבה vivo מסחטות. מקליט תאים בזמן אמת היה מנוצל ברציפות להתבונן התקדמות של לבלוב אנגיוגנטית מן spheroids עבור 24 h. שיטת התיוג הפלואורסצנטי של תא חי החלה גם על בדרכי ההתאמה של כל סוג תא במהלך היווצרות נבט. פוטנציאל אנגיוגנטי היה כולל על ידי ספירת מספר נבטים ומדידת האורך המצטבר של נבטים שנוצרו מההרואידים הבודדים. חמש השפעות אקראיות שנבחרו. נותחו לכל קבוצה ניסיונית ניסויי השוואה הראו כי ECFCs + MSCs spheroids הראו מספר נבט גדול יותר ואורך נבט מצטבר בהשוואה ל ECFCs בלבד spheroids. Bevacizumab, שאושרו על-ידי ה-FDA מעכב אנגיוגנזה, נבדק עם מערכת החדשה שפותחה שיתוף תרבות ספרואיד במערכת כדי לאמת את הפוטנציאל שלה למסך תרופות אנטי-אנגיוגנטית. ערך IC50 עבור ecfcs + MSCs spheroids לעומת ecfcs בלבד הספרואידים היה קרוב יותר לריכוז פלזמה יעיל של אווסטין המתקבל ממודל העכבר הגידול של מבע. המחקר הנוכחי מצביע על כך 3D ECFCs + MSCs ספרואיד מערכת שיטת אנגיוגנזה רלוונטית לאנגיוגנזה פיזיולוגי, והוא יכול לחזות ריכוז פלזמה יעיל מראש של ניסויים בבעלי חיים.
Introduction
כ 500,000,000 אנשים ברחבי העולם צפויים להפיק תועלת של אנגיוגנזה-מודלטינג טיפול עבור מחלות כלי דם משויכים כגון דלקת מפרקים שגרונית, מחלות לב וכלי דם, גרורות גידול1. לפיכך, התפתחות התרופות השולטות באנגיוגנזה הפכה לאזור מחקר חשוב בתעשיית הפרמצבטיקה. במהלך התפתחות התרופה, בחקר החיות הvivo יש צורך לבחון את ההשפעות של מועמדים לסמים בפונקציות פיזיולוגיות ואינטראקציות מערכתיות בין איברים. עם זאת, בעיות אתיות ועלויות הגדילו את החששות לגבי ניסויים בבעלי חיים2. לכן, יש צורך לשפר את מערכות המערכת החוץ-גופית כדי לקבל מידע מדויק וצפוי יותר שיוביל לקבלת החלטות טובה יותר לפני ניסויים בבעלי חיים. הזרם הנוכחי באנגיוגנזה, בדרך כלל למדוד התפשטות, פלישה, הגירה, או היווצרות המבנה הצינורי של תאי האנדותל (ECs) הנזרע דו מימדי (2D) לוחות התרבות3. האנגיוגנזה הדו מספר אלה הם מהירים, פשוטים, כמותיים וחסכוניים, ותרמו באופן משמעותי לגילוי הסמים המואפטים באנגיוגנזה. עם זאת, נותרו מספר נושאים שופרו.
2D כגון מערכות שיטת החוץ הגופית לא יכול לשקף אירועים מורכבים בשלב רב של אנגיוגנזה המתרחשת ב vivo התנאים הפיזיולוגיים, המוביל תוצאות לא מדויקות הגורמות לסתירות בין נתוני שיטת חוץ גופית ותוצאות ניסוי קליני4. התנאים תרבות 2D גם לגרום לשינוי של פנוטיפים סלולריים. לדוגמה, לאחר התפשטות בלוחות התרבות דו-ממדית, ecs יש פנוטיפ הסלולר חלש המתבטא על ידי ביטוי מופחת של CD34 ומספר אותות השולטים התגובות הסלולר5,6. כדי להתגבר על מגבלות מערכות שיטות האנגיוגנזה המבוססות על תרבות דו-ממדית, פותחו מערכות שיטת אנגיוגנזה תלת-ממדית (3D). לבלוב ואחריו היווצרות מבנה צינורי מתוך spheroids שנוצר על ידי ecs משקפים vivo ניאו-ואסיקולריזציה תהליכים7,8. לפיכך, שיטת האנגיוגנזה התלת-ממדית נחשבה למערכת שיטה יעילה לסינון תרופות פרו-אנאנציקליות פוטנציאליות.
רוב 3d האנגיוגנזה ספרואיד בחני לנצל רק ecs, בעיקר האדם וריד הטבור בתאי הטבורי (huvecs) או האדם מיקרוכלי הגוף האנושי מיקרו-סקולרית (hdmecs) כדי להתמקד בתגובה התאית של ecs במהלך האנגיוגנזה. עם זאת, נימים בדם מורכבים משני סוגי תאים: ECs ו כריתת קרום הלב. פירוט האינטראקציה הדו-כיוונית בין ECs לקרום הלב היא קריטית לשלמות כלי הדם הנכונים ולתפקוד. מספר מחלות, כגון שבץ תורשתי, רטינופתיה סוכרתית, ומומים ורידים, משויכים לצפיפות שונה בקרום הלב או לירידה המצורף לקרום הלב לאנדותל9. כלציטים מוכרות גם כמרכיב מרכזי בתהליך האנגיוגנטי. לייצב את מבני הספינה. שנוצרו מחדש ע י ECs בהקשר זה, שיטת האנגיוגנזה של מונו-תרבות, אינה משלבת כבלי קרום הלב7,10. לכן, הספרואידים של התרבות שנוצר על ידי ECs ו קרום הלב עשוי לספק גישה רבת ערך לחיקוי הדוק יותר של אירועים האנטי-אנגיוגנטיים הפיזיולוגיים.
המחקר הנוכחי שמטרתו לפתח שיתוף תרבות תלת-ממד בשילוב האנאיד אנגיוגנזה עם שילוב של מושבת האדם האנושי היוצרים תאים (ECFCs) ותאי גזע mesenchymal (MSCs) כדי לשקף יותר מקרוב vivo אנגיוגנזה. מערכת שיתוף תרבות ספרואיד כהרכבה בייצוג בלתי מתורבת של כלי דם רגיל הוקמה לראשונה על ידי Korff et al. ב 200111. הם שילבו HUVECs ואת עורק הטבור האנושי תאים השריר חלקה (HUSMCs), והפגינו כי שיתוף התרבות של שני תאים בוגרים כלי דם ירדו את הפוטנציאל לבלוב. Ecs בוגרת (huvecs) ידועים בהדרגה לאבד את יכולתם להתרבות ולהבדיל, אשר משפיע לרעה על תגובות האנגיוגנזה שלהם12,13. תאים בוגרים בעלי כלי דם (HUSMCs) יכולים לגרום להפעלת תא אנדותל באמצעות הארכה של מקדם הגידול של כלי הדם (באמצעות התגובה המתכלה)11. ההבדל העיקרי בין Korff לבין מערכת שיתוף התרבות שלנו ספרואיד הוא סוגי התא המשמשים. החלתי שני סמנים מוקדמים של כלי הדם, ECFCs ו MSCs, כדי ליצור מערכת שיטת אנגיוגנזה מתאימה למסך ולחקירת סוכנים פרו-או-אנטי-אנגיוגנטיים. ECFCs הם הקודמן של ECs. ל-ECFCs יש קיבולת הפצה איתנה לעומת ECs בוגרת14, המאפשרת להתגבר על המגבלה של ecs. Ecfcs תורמים להיווצרות כלי חדש בתנאים רביםשלאחר לידהלאחר לידה15,16,17. MSCs הם תאי גזע בעלי עוצמה גבוהה, שיש להם את היכולת להבדיל לתוך קרום הלב, ובכך לתרום לאנגיוגנזה18,19.
בדוחות הקודמים, ecfcs ו MSCs הראו השפעות סינגיסטיים על היווצרות צינור מבחנה20, ב vivo ניאו-vascularization21,22, ו reperfusion משופר של רקמות האיסכמי23,24. במחקר הנוכחי, ECFCs ו MSCs שימשו ליצירת spheroids שיתוף תרבות ומוטבע סוג אני קולגן ג’ל כדי לשקף בסביבה vivo 3D. קולגן נחשב מרכיבים עיקריים של מטריצה החילוץ (ECM) סביב Ecm25. ה-ECM ממלאת תפקיד קריטי בוויסות התנהגות התא26. פרוטוקול השימוש המוצע כאן יכול להתבצע בקלות ובמהירות בתוך יומיים באמצעות טכניקות מעבדה נפוצות. עבור מעקב תאים אפקטיבי במהלך לבלוב התהליך, כל סוג תא יכול להיות מתויג באופן מפוקח ומנוטרים באמצעות מקליט תא בזמן אמת. המערכת החדשה הוקמה 3D שיתוף התרבות מערכת שיטת אנגיוגנזה מיועדת להגביר את הרגישות להערכת מודולטורים פוטנציאליים מודולים ולספק מידע צפוי מראש במחקר vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הנוכחי מציג שיפור מערכת האנגיוגנזה מחוץ למערכת שיטה ניצול שיתוף התרבות הנוצרת על ידי שני ושלתי cell האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs. Co-תרבות ספרואיד מערכת יכול לחקות vivo כלי הדם נבט היווצרות, אשר הוא שבוצעה באמצעות אינטראקציה והתאגדות בין תאי האנדותל וכלי קרום הלב. לעומת אחרים באנגיוגנזה מתורבת…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק (17172mfds215) מהמשרד של מזון ובטיחות סמים, הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה (msip) (2017r1a2b4005463), ואת תוכנית המחקר הבסיסי המדע באמצעות ה הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
- Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
- Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
- Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
- Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
- Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
- Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
- Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
- Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
- Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
- Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
- Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).
