내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템
Summary
3차원 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 생리적 혈관신생을 모방하도록 설계된다. 공배양 스페로이드는 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, ECFC 및 MSC에 의해 형성되고, 콜라겐 겔에 내장된다. 새로운 시스템은 혈관 신생 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 보다 관련성이 있는 정보를 제공합니다.
Abstract
혈관신생 분야의 연구는 혈관신생이 류마티스 관절염, 후암병증, 심혈관 질환과 같은 50가지 이상의 병리학적 상태의 특징이라는 인식과 함께 지난 수십 년 동안 공격적으로 성장해 왔습니다. 및 종양 전이. 혈관 신생 약물 개발 동안, 생리 적 혈관 신생 과정을 반영하기 위해 적절한 세포 유형과 적절한 조건을 가진 시험관 내 분석 시스템을 사용하는 것이 중요합니다. 주로 내피 세포를 이용한 현재 체외 혈관신생 분석 시스템의 한계를 극복하기 위해 3차원(3D) 공동 배양 스페로이드 발아 분석 시스템을 개발했습니다. 공배양 스페로이드는 5 대 1의 비율로 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, 내피 콜로니 형성 세포(ECFC) 및 중간엽 줄기 세포(MSCs)에 의해 생산되었다. ECFC+MSCs 스페로이드는 생체 내 세포외 환경을 모방하기 위해 타입 I 콜라겐 매트릭스에 내장되었다. 실시간 세포 레코더는 24시간 동안 구형으로부터 의 혈관신생 발아의 진행을 지속적으로 관찰하기 위해 활용되었다. 혈관 신생 전위는 새싹의 수를 계산하고 개별 스페로이드에서 생성 된 콩나물의 누적 길이를 측정하여 정량화되었다. 무작위로 선택된 5개의 스페로이드를 실험군당 분석하였다. 비교 실험은 ECFC + MSCs 스페로이드가 ECFC 전용 스페로이드에 비해 더 큰 새싹 수와 누적 싹 길이를 보였다는 것을 보여주었습니다. 베바시주맙은 FDA 승인 혈관신생 억제제로서 새로 개발된 공동 배양 스페로이드 분석 시스템으로 항혈관신생 약물을 스크리핑할 수 있는 가능성을 검증했습니다. ECFC 전용 스페로이드에 비해 ECFC+MSCs 스페로이드에 대한 IC50 값은 이종이식 종양 마우스 모델으로부터 수득된 베바시주맙의 유효 혈장 농도에 가까웠다. 본 연구는 3D ECFC+MSCs 스페로이드 혈관신생 분석 시스템이 생리적 혈관신생과 관련이 있음을 시사하며, 동물 실험에 앞서 효과적인 혈장 농도를 예측할 수 있다.
Introduction
전 세계적으로 약 5억 명이 류마티스 관절염, 이종병증, 심혈관 질환 및 종양 전이와 같은 혈관 기형 관련 질환에 대한 혈관신생 조절요법의혜택을 받을 것으로 예상된다 1. 따라서 혈관신생을 조절하는 약물의 개발은 제약 산업에서 중요한 연구 분야가 되고 있다. 약물 개발 과정에서 생체 내 동물 연구는 생리 적 기능과 장기 간의 전신 상호 작용에 대한 약물 후보의 효과를 탐구할 필요가 있습니다. 그러나, 윤리적 및 비용 문제는 동물 실험에 대한 우려를 증가2. 따라서, 동물 실험 전에 더 나은 의사 결정으로 이어지는 더 정확하고 예측 가능한 데이터를 얻기 위해 시험관 내 분석 시스템이 개선되었습니다. 현재 체외 혈관신생 분석기는 일반적으로 2차원(2D) 배양판3에 시드된 내피세포(ECs)의 증식, 침범,이동 또는 관형 구조 형성을 측정한다. 이러한 2D 혈관신생 분석은 빠르고, 간단하고, 양적이며, 비용 효율적이며, 혈관신생 조절 약물의 발견에 크게 기여했다. 그러나 몇 가지 문제는 여전히 개선되어야 합니다.
이러한 2D 체외 분석 시스템은 생체외 생리학적 조건에서 발생하는 혈관신생의 복잡한 다단계 사건을 반영할 수 없으며, 시험관내 분석 데이터와 임상 시험 결과 사이의 불일치를 유발하는 부정확한 결과를 초래한다4. 2D 배양 조건은 또한 세포 표현형의 변화를 유도한다. 예를 들어, 2D 배양 플레이트에서 증식 후, ECs는 CD34의 감소된 발현 및 셀룰러 반응을 제어하는 여러신호에의해 나타나는 약한 세포 표현형을 갖는다5,6. 2D 배양계 혈관신생 분석 시스템의 한계를 극복하기 위해, 3차원(3D) 스페로이드 혈관신생 분석 시스템이 개발되었다. 발아 후 ECs에 의해 형성된 스페로이드로부터의 관형 구조 형성은 생체 내 신혈관화 과정7,8. 따라서, 3D 스페로이드 혈관신생 분석기는 잠재적인 프로-또는 항혈관신생 약물을 스크리닝하기 위한 효과적인 분석 시스템으로 간주되고 있다.
대부분의 3D 스페로이드 혈관신생 분석사는 혈관신생 동안 ECs의 세포 반응에 초점을 맞추기 위해 주로 인간 배꼽 내피 세포(HUVECs) 또는 인간 진피 미세혈관 내피 세포(HDMECs)만을 활용합니다. 그러나, 혈액 모세 혈관은 두 가지 세포 유형으로 구성 됩니다:ECs와 pericytes. EC와 pericytes 사이의 정교한 양방향 상호 작용은 적절한 혈관 무결성 및 기능에 매우 중요합니다. 유전성 뇌졸중, 당뇨망막병증 및 정맥기형과 같은 여러 질병은 내피에 대한 변경된 후피세포 밀도 또는 감소된 회음부 부착과 관련이있다 9. Pericytes는 또한 혈관 신생 프로세스의 핵심 요소로 알려져 있습니다. PERICYTES는 EC에 의해 새로 형성 된 선박 구조를 안정화하기 위해 모집된다. 이와 관련하여, 모노배양 스페로이드 혈관신생 분석제는7,10을포함하지 않는다. 따라서, ECs 및 pericytes에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드는 생리적 혈관신생 사건을 보다 밀접하게 모방하는 귀중한 접근법을 제공할 수 있다.
본 연구는 생체 내 혈관신생에 보다 밀접하게 반영하기 위해 인간 내피 콜로니 형성 세포(ECFC)와 중간엽 줄기 세포(MSCs)의 조합으로 3D 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석기를 개발하는 것을 목표로 하였다. 정상 혈관의 시험관내 표현 어셈블리로서 공동 배양 스페로이드 시스템은 2001년11년에Korff et al.에 의해 처음 설립되었다. 그(것)들은 HUVECs및 인간 배꼽 동맥 평활근 세포를 결합하고 (HUSMC), 2개의 성숙한 혈관 세포의 공동 배양이 발아 잠재력을 감소한다는 것을 설명했습니다. 성숙한 ECs(HUVECs)는 점진적으로 증식및 분화능력을 상실하는 것으로 알려져 있으며, 이는 그들의 혈관신생 반응에 부정적인 영향을 미치는12,13. 성숙한 분방 세포(HUSMC)는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 반응성(VEGF)의 제거를 통해 내피 세포 불활성화를 일으킬 수있다(11). Korff와 우리의 공동 배양 스페로이드 시스템의 주요 차이점은 사용되는 세포 유형입니다. 우리는 두 개의 혈관 전구체, ECFC 및 MSC를 적용하여 적절한 혈관 신생 분석 시스템을 확립하여 프로 또는 항 혈관 신생 제제를 선별하고 조사했습니다. ECFC는 EC의 선구자입니다. ECFC는 성숙한 EC14에비해 강력한 확산 용량을 가지며, 이는 EC의 한계를 극복할 수 있게 합니다. ECFC는 많은 산후 병리생리학적 조건에서 새로운 혈관 형성에기여15,16,17. 미세포는 pericytes로 분화하는 능력을 가진 다능성 줄기 세포이며, 이에 의해 혈관신생 에 기여18,19.
이전 보고서에서, ECFC 및 MSCs는 생체외 관형성(20)및 생체내 신혈관화21,22,허혈성 조직의 재관류 개선에 대한 상승효과를 보였다(23,24). 본 연구에서, ECFC 및 MSC는 생체 내 3D 환경을 반영하기 위해 동배전 스페로이드를 형성하고 타입 I 콜라겐 겔에 내장된 것을 사용하였습니다. 콜라겐은 ECs25를둘러싼 세포외 기질(ECM)의 주요 성분으로 간주된다. ECM은 세포 행동 조절에 중요한 역할을 한다26. 여기에서 제안된 분석 프로토콜은 일반적인 실험실 기술을 사용하여 2 일 안에 쉽고 빠르게 수행 될 수 있습니다. 발아 과정 동안 효과적인 세포 추적을 위해, 각 세포 유형은 실시간 세포 레코더를 사용하여 형광 표지 및 모니터링될 수 있다. 새로 설립된 3D 공동 배양 스페로이드 혈관 신생 분석 시스템은 잠재적인 혈관 신생 변조기 를 평가하기위한 감도를 높이고 생체 내 연구에 앞서 예측 가능한 정보를 제공하도록 설계되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구는 두 개의 인간 혈관 세포 선조, ECFC 및 MSC에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 활용한 생체외 혈관 신생 분석 시스템을 개선하여 소개합니다. 내피 세포와 pericytes 사이의 상호 작용 및 통합에 의해 달성. ECs 매개 혈관신생만을 반영하는 다른 체외 혈관신생 분석과 비교하여, 이러한 공동 배양 분석 시스템은 세포 상호작용, 발아, 관 형성을 포함한 생리적 혈관신생의 다단계 캐스케이드…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 식품의약품안전처의 보조금(17172MFDDS215), 한국정부의 한국연구재단(NRF) 보조금(2017R1A2B4005463) 및 기초과학연구프로그램을 통해 지원되었다. 한국국립연구재단(NRF)은 교육부의 지원을 받아 (2016R1A6A1A1A03007648)을 지원한다.
Materials
| 0.05 % Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X) | Gibco | 21600-010 | PBS (10X) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1X) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
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